食品中霉菌和酵母分布检测和鉴定

食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定福建省疾病预防控制中心马群飞霉菌和酵母的基本特性霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故102〜104个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH3〜8,有些霉菌可以在pH2,酵母在pH1.5时生活。水活度要求0.99〜0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20〜30°C,部分霉菌可以在不低于一7C的温度下生长。酵母一般在0〜45C时生长。耐热能力较差，酵母细胞55〜56C几分钟就被杀死。少数霉菌的抱子（如丝衣霉）则可在90C中耐受几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO和SO等。有些酵母酯酶22活性高并能合成B族维生素。食品中酵母的常见类群在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤2酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多抱丝抱酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。2.3水果和蔬菜：两者的差别主要是pH值。水果通常为酸性，pH值在1.8〜2.2左右（味浓的水果，柠檬等）到pH4.5〜5.0（西红柿等）之间，对细菌有抵抗力。而蔬菜的pH值接近中性，对细菌侵入敏感。通常引起水果腐败的原因是霉菌而非酵母，只有柠檬型克拉克酵母可侵入破损的草莓。2.4果酱、蜜饯、果汁和干果：这类食物的特点是水活度低。一些接合酵母能使加热不完全的果酱败坏。鲁接合酵母和拜尔接合酵母可引起包装好的巧克力变质。即使仅沾上几个细胞，最终也将生长而产生大量气体至将外包装胀破。拜尔接合酵母同样能使果汁变质，它能在水活度很低并含防腐剂的食品中生长。无花果由于种子腔开口易被酵母菌污染，有时嗜干酵母可导致无花果干的腐败。2.5葡萄酒：酒中9〜22%的乙醇、3〜3.6的pH值和防腐剂（一般是SO和山梨酸）能2抑制多种微生物生长。二孢接合酵母和酿酒酵母却能生长于18%的乙醇中，而路德酵母能抵抗SO和山梨酸，它们使葡萄酒浑浊，生成沉淀和怪味物质。22.6啤酒：啤酒花（Hops）和2〜6%的乙醇、CO及低pH值加上厌氧环境，营养成分2有限，能在其中生长的微生物量受到限制。酵母属可使之浑浊并产生丁二醇、酚类等异味物质。浸渍制品：蔬菜和水果在浸渍时由于未能隔绝空气造成膜生酵母及一些丁酸细菌生长而引起变质。正常情况下，这类食品中，酵母菌是优势菌群之一。无酒精饮料：常因酵母属、毕赤酵母属和球拟酵母属等生长而腐败。充碳酸气的饮料少见霉菌性变质，有时可见酵母引起沉淀物产生。美国食品和管理局（FDA）要求此类食品每毫升酵母数少于50个，霉菌少于100个。粮食：在干燥情况下，酵母并非优势菌。国内有报导红酵母属引起湿糯米粉制成的元宵变色，失去固有粘性，但毒理学检查未见异常。3．食品中霉菌的类群霉菌分布广泛，但它与细菌主要的不同之一便是通过空气中的分生孢子传播。蔬菜是霉菌生长的良好基质，霉菌还是水果、浆果、谷物、面包等变质的主要原因。它还能在不适于微生物生长的皮革、衣物上生长。比如枝孢霉常存在于土壤和植物中，对植物无害，它也是空气中常见真菌，容易导致衣物出现小小的黑斑。霉菌多为需氧菌，主要生长于和空气接触的物体表面。嗜冷霉菌可在一7〜0°C生长，如镰刀菌、青霉、枝孢霉。耐热的丝衣霉常导致加工过的水果变质。许多霉菌特异性高，仅在特殊的环境下存活。例如镰刀菌在低温能生长，常导致冷库贮存的大蒜、大麦芽变质。青霉常在柑桔中常检出，它能够抵抗防腐剂，对于生产影响较大。谷类：霉菌很容易成为优势菌。田野霉对收获后的谷物霉变没有多大意义。霉菌和酵母数量是食品加工卫生史的一种指标。霉菌数高的粮食保存期相当短。水果和蔬菜：水果临近成熟时pH值升高，表皮变软，防御屏障薄弱，易为霉菌侵染。青霉是柑桔类水果变质的最常见原因，有时是白地霉或柑桔链孢霉。扩展青霉甚至可使冷藏的苹果和梨腐烂。变质时水果先变软，表面有淡褐色斑点并迅速扩展至全果。即使将变质的部分削去也不能除去扩散的展青霉素。所以，被扩展青霉侵染过的蔷薇科水果制成的果酱和果汁中，这种致癌致畸的毒素阳性检出率非常之高。在我国北方省份生产的苹果、山楂等水果的果酱和果汁中多次检出展青霉素。丛梗孢霉和黑根霉能使桃、杏等核果腐烂。蔬菜腐烂主要是由葡萄孢霉（豌豆、洋葱、西红柿等）、曲霉（洋葱等）、镰刀菌（洋葱、大蒜、马铃薯等）和交链孢霉（番茄、瓜叶类蔬菜）造成的。根霉可引起几乎所有的水果和蔬菜的霉烂。市售蔬菜的主要病害可由曲霉、青霉、枝孢霉等造成。干燥食品：晒干的谷物常见有散囊菌。黄曲霉和寄生曲霉的检出有重大意义。大量青霉出现表明在干燥过程中可能有生长。水活度高的食品如面包、蛋糕，可因青霉及其他常见霉菌生长引起发霉。果酱、蜜饯、果汁和干果：发霉果酱中常见散囊菌，时有嗜干青霉。金锈孢霉引起蜜饯变质，嗜旱二孢霉引起甘草腐败。经巴氏消毒后的果汁中虽有丝衣霉存在，但它们不能生长。杏、桃、梨和香蕉制干前二氧化硫的熏蒸抑制了多数微生物。未经处理的干果易因嗜干霉菌如散囊菌、嗜旱二孢霉等变质。果仁中霉菌毒素问题较多。4．霉菌和酵母总数测定4.1基本要求：霉菌培养应用专用培养箱，培养温度在25〜30°C之间对结果影响不大。为尽快得到结果，我们以27C为培养温度。菌落计数应于培养后的72小时进行第一次观察。这时主要是观察那些密集生长的平皿，以免到第五天之后，菌落生长成片而难以计数。实验时手脚要快，动作宜轻，培养过程中观察平板时，动作稍重，生长快速的霉菌孢子就会在培养基内扩散，导致二次污染，结果读数异常。特别是翻转平板进行培养，观察时再转过来，特别容易导致孢子飞散。一般以第五天的读数为最终计数。但观察应持续七天。由于霉菌和酵母菌落较大，光线正常时可以方便地计数。选择那些霉菌数为10〜100个之间的平皿计数，而不是象细菌的30〜300个。有时10〜50个菌落的平皿也是受肯定的。霉菌和酵母培养时间较长，用于倾注的培养基量应稍多于细菌计数，约为15〜20mL,以保证培养时不至于造成培养基过分干燥。培养箱内温湿度调节不当，会造成霉菌蔓延生长或培养基失水。尤其是当湿度过高时，常导致嗜湿的根霉、木霉、毛霉、链孢霉等的强烈污染。当然，每批实验时空白对照都是要做的。霉菌和酵母计数培养基传统霉菌和酵母计数时用酸性培养基来抑制细菌。酸化的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）是一致公认最好的酸化培养基。用酸，如酒石酸调pH至3.5后用于计数，效果尚令人满意。酸化培养基也有无法避免的缺点，如霉菌菌落的扩展，耐酸细菌的生长，蛋白质出现沉淀，以及抑制了不耐酸霉菌和酵母的生长等。最后还有一点，生长在酸化培养基上的霉菌和酵母形态异常，不利于分类鉴定。目前普遍使用抗生素培养基，上述缺点明显改善。此方法经济有效，培养基易制备，不会破坏正常的菌落形态。常用的抗生素类药物有氯霉素（50〜100mg/kg）、土霉素（100mg/kg）、硫酸庆大霉素（50mg/kg）、链霉素（3g/kg）、盐酸金霉素（20mg/kg）等。两种抗生素合并使用效果更好。硫酸庆大霉素和氯霉素耐高压，可以预先添加在培养基中一起灭菌，而其他的抗生素一般在培养基温度降至50°C以下后添加。注意，抗生素效用在碱性条件下（pH>8.0）降低。孟加拉红（RoseofBengal）常被用于制备霉菌和酵母的计数琼脂。主要作用是限制霉菌菌落的蔓延生长，而不是象某些书本所描述的那样，用于抑制细菌。孟加拉红也被称为虎红，化学名是四碘四氯荧光素钠盐或钾盐。添加孟加拉红的培养基上生长的霉菌菌落较为致密，而且生长的菌落背面显出较浓的红色，有助于计数。唯一的缺点是孟加拉红溶液对光敏感，易分解成一种黄色的有细胞毒作用的物质。平时应将孟加拉红溶液用不透光的容器或袋子包好，贮存在冰箱中。已变黄的溶液和琼脂应弃去。著名的应用孟加拉红的培养基是马丁琼脂（Matin'sMedia，亦称虎红琼脂、孟加拉红琼脂）。孟加拉红可添加在PDA中。邻氯对硝基苯胺（2mg/kg）有类似孟加拉红的作用。国外学者也常用孟加拉红琼脂，其中添加孟加拉红25mg/kg，另外附加邻氯对硝基苯胺2mg/kg，氯霉素50mg/kg，金霉素50mg/kg。美国FDA尚未认可孟加拉红琼脂，它的标准仍以PDA的酸化法和抗生素法为基本。国家标准规定，霉菌和酵母数检验时使用的培养基为孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。原标准只要求做粮食霉菌总数时，使用高盐察氏琼脂。高盐察氏琼脂使用时也有抑制力过强的缺点，而毛霉和根霉等却仍然生长旺盛。一般使用CAO时，应同时使用孟加拉红琼脂，以反映食品真菌的菌相全貌。现在高盐察氏琼脂已废止。不过，标准中忘记删除流程图中的CA0。察氏琼脂（Czapek）和PDA通常只用于分类鉴定。当酵母为优势菌群时，使用MEGA计数。配方：麦芽浸膏20克，蛋白胨1克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1升，调pH5.4，121°C15min,添加50mg/kg氯霉素和金霉素以抑制细菌。如买不到麦芽浸膏，可以向啤酒厂购买麦芽汁(未添加啤酒花,withouthops)代替。上述培养基均有干粉出售。使用时十分方便，但各品牌的质量不一。霉菌和酵母计数方法稀释平板法最常用于食品样品的检验。国家标准种样品处理等方法与细菌的菌落总数计数方法大致相同。事实上，可以在进行菌落总数计数的同时，进行霉菌和酵母总数的检验。两者之间的差异为培养基和培养温度的不同。有人认为，霉菌和酵母计数用表面涂布平板法能提高检出率，因为霉菌有气生菌丝，好氧性强，酵母耐热性差，不耐融化琼脂的热力。而且可用不透明的培养基。检验方法同细菌检验常规，不再赘述。但因使用样品量较少，对含菌量少的样品，此法可能不够准确。对于国家标准中规定的霉菌直接计数方法，引用了著名的霍华德(Howard)霉菌计数法，适用于检验番茄及其加工制品，但是需要专门的技术培训和相应设备。5.霉菌和酵母分类鉴定霉菌中的多数种类不会产生有害的霉菌毒素，危害较小，而少数菌株即使污染数量不多，产生的霉菌毒素却有极大的危害，因此单纯的霉菌和酵母计数并不能反映食品的安全性，只有知道了食品的污染菌菌相，才能更准确地判断。分类鉴定的意义就在于此。但是，霉菌和酵母的分类鉴定十分繁琐。分离和纯化：常用方法有直接点种法、划线法、稀释平板法。稀释平板法同常规检验，除了培养基用具选择性的外，还要求每皿中长出的霉菌菌落在十个左右，太多则影响分离效果。另外，如采用倾注法，长在琼脂深处的霉菌发育不良，无法观察其菌落特征。可改用表面涂布法。此方法手续繁琐，但所得种类较多。直接点种法将食物小颗粒直接种于分离培养基上，25C培养2〜3天后，用接种针挑取抱子或菌丝，转接于适当的琼脂斜面上待鉴定。此方法分纯效果略逊。划线法是用无菌水洗涤样品，用接种环沾取液体在分离培养基上划线分离。此法最简便，但可能遗落部分菌株。真菌分类系统：全世界已知真菌有上千属，十万种。四十年多来，真菌的研究飞速发展，尽管在真菌超微结构、生理生化、医学真菌学、药用真菌学、真菌毒素、食用真菌人工培养开发等方面已经获得了很多进展，但是，真菌学仍然是微生物学的薄弱环节，还有待进一步深入研究。目前，在系统学方面，受到公认的分类体系不多。酵母分类鉴定：酵母在真菌分类系统中分别隶属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。为方便起见，国际上仍沿用酵母（Yeast）这个非分类学名词。酵母分类以荷兰LodderJ.主编《TheYeast—ATaxonomicStudy》（罗德，酵母一分类研究）1970年再版本为比较完整的系统。鉴定一株酵母，要花费极大的人力物力。因其形态和生理方面的试验项目繁多，一般微生物实验室难以开展。分离酵母时，现在一般不用低pH培养，而以抗生素抑制细菌。嗜干酵母常规方法很难检出，因其要求低水活度，可以用浓缩果汁为培养基，或添加30％葡萄糖，稀释样品时也用30％葡萄糖溶液。浓缩果汁中此类菌数量不得超过1/50mL。在检查分离抗防腐剂的酵母时，培养基添加0.5%醋酸能促进抗保鲜剂酵母的生长并抑制其他酵母。鉴定时，先根据细胞形态特征进行属以上的判断，如是否有性繁殖，子囊孢子、掷孢子、冬孢子和担孢子数量、形态，无性生殖是出芽还是裂殖，有无假菌丝等等。种的确定主要以生理特性，尤其是糖类发酵或同化为依据，还要包括无维生素生长、酯酶活性、色素形成、同化硝酸盐、酯类产生情况、对放线菌酮抗性、低水活度生长等等生理特点，常常需要数周后才有鉴定结果。使用API20C或Biolog全自动细菌分类系统等可以大大加快检索鉴定速度。目前，上述设备及类似设备研制较多，但普及有一定难度，主要原因是其价格居高不下。这种全自动或半自动检索代表了今后微生物分类研究的发展方向。目前鉴定一株酵母需花费约5美元。霉菌分类鉴定5.4.1霉菌分类培养基：丝状真菌没有完整的分类系统，常用Smith系统。霉菌培养时常因不同的培养基而在生理和形态方面表现出极大的差异，故描述菌种时应注明鉴定培养基。最为常用的是察氏琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂，通常对青霉、曲霉菌种用察氏琼脂培养，其他霉菌则应选用PDA。对于镰刀菌属的菌种，必要时要选用六种以上的不同培养基来分别显示它的不同培养特征。对有特殊要求的霉菌，培养时也应满足其条件，低水活度食品如果酱、粮食中的嗜干霉菌，应使用大量添加蔗糖或食盐的高渗培养基。培养时间：直接采用霉菌和酵母计数后的平板进行霉菌分类鉴定是可行的。但在培养5〜7天时，菌种的形态特征不明显，不容易观察。通常于培养7〜14天时鉴定。染色液：制片时染色液是必需的。常用两种：乳酸品红液（百万分之一酸性品红乳酸溶液），染色速度快，尤其是幼龄组织上色快。胞壁组织清晰，适于显微摄影。1896年Amann氏发明的乳酸苯酚棉蓝染色液（10克石炭酸溶于10mL热蒸馏水，再加入甘油20mL、乳酸10mL、棉蓝cottonblue0.22克即成），折光率好，背景微蓝，细胞不变形，杀菌防腐防腐，且不易干燥，保持时间较长。霉菌鉴定程序：霉菌分类的困难关键在于培养特征的观察和描述。使用检索表时一定要对每一分类特征判断清楚，以免因一次错误而误入歧途。经常进行霉菌分类鉴定的单位或部门需要专人负责这项工作，临时人员是无法胜任的。鉴定时先肉眼观察平板上生长的单个菌落，注意菌落颜色、质地等。然后用显微镜由低倍镜、高倍镜至油镜观察，注意菌丝形态、孢子梗、分生孢子和有性器官颜色、形态等。这是鉴定时一定要仔细观察的指标。以曲霉鉴定为例。先进行察氏琼脂观察。曲霉在察氏琼脂上颜色和形态分化较好。根据菌落有无绿色调产生分成两大类。有时需要放几