m第十四章基因工程

临床医学院生物化学教研室佘集凯

基因重组和基因工程

第十四章目录第一节

DNA的重组

DNARecombination

DNA重组细菌的基因转移与重组接合作用、转化作用、转导作用转座重组同源重组特异位点的重组发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体拼接重组体

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录片段重组体：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录二、细菌的基因转移与重组接合作用转化作用转导作用细胞融合（一））接合合作用用当细胞胞或细细菌通通过菌菌毛相相互接接触时时，质质粒DNA从一一个细细胞（（细菌菌）转转移至至另一一细胞胞（细细菌）），这这种DNA转移移称为为接合作作用。质粒——细菌染染色体体外的的小型型环状状双链链DNA分分子可接合合质粒粒如F因因子子(Ffactor)（二））转化化作用用通过自自动获获取或或人为为地供供给外外源DNA，使使细胞胞或培培养的的受体体细胞胞获得得新的的遗传传表型型，称称为转化作作用。例：溶菌时时，裂裂解的的DNA片片段被被另一一细菌菌摄取取。目录录（三））转导导作用用当病毒毒从被被感染染的细细胞（（供体体）释释放出出来、、再次次感染染另一一细胞胞（受受体））时，，发生生在供供体细细胞与与受体体细胞胞之间间的DNA转移移及基基因重重组即即为转导作作用。λ噬菌菌体的的生活活史溶菌生生长途途径溶源菌菌生长长途径径例目录录目录录三、位位点特特异重重组位点特特异重重组是由整整合酶酶催化化，在在两个个DNA序序列的的特异异位点点间发发生的的整合合。例（（一）λ噬菌菌体DNA的整整合λ噬菌菌体的的整合合酶识识别噬噬菌体体和宿宿主染染色体体的特特异靶靶位点点发生生选择择性整整合；；反转转录病病毒整整合酶酶可特特异地地识别别、整整合反反转录录病毒毒cDNA的长末端端重复复序列列(LTR)。例（二））细菌菌的特特异位位点重重组鼠伤寒寒沙门门杆菌菌H片片段倒倒位决决定鞭鞭毛相相转变变hix为反向向重复复序列列，它它们之之间的的H片片段可可在Hin控制制下进进行特特异位位点重重组(倒位位)。。H片片段上上有两两个启启动子子P，，其一一驱动动hin基因表表达，，另一一正向向时驱驱动H2和和rH1基基因表表达，，反向向(倒倒位)时H2和和rH1不不表达达。rH1为H1的的阻遏遏蛋白白基因因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段H1鞭毛素沙门氏氏菌H片段段倒位位决定定鞭毛毛相转转变hinH2IDNA启动序列H1启动序列hinH2IH1例（三））免疫疫球蛋蛋白基基因的的重排排免疫球球蛋白白(Ig)，由由两条条轻链链(L链)和两两条重重链(H链链)组组成，，分别别由三三个独独立的的基因因族编编码，，其中中两个个编码码轻链链(和)，一一个编编码重重链。。轻链的的基因因片段段：重链的的基因因片段段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因因的V-D-J重排排和轻轻链(IgL)基因因的V-J重排排均发发生在在特异异位点点上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的两侧侧均存存在保保守的的重组组信号号序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重重排的的重组组酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有有两个个，分分别产产生蛋蛋白质质RAG1和RAG2。。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内内转酯酯反应应单链切切开转移核核苷酸酸修复、、连接接免疫球球蛋白白基因因重排排过程程目录录四、转转座重重组由插入入序列列和转转座子子介导导的基基因移移位或或重排排称为为转座(transposition)。典型的的插入入序列列(IS)组成：：二个分分离的的反向向重复复(IR)序列列一个转转座酶酶（transposase)编编码基基因特有的的正向向重复复序列列IRTransposaseGeneIR发生形形式：：保守性性转座座复制性性转座座（一））插入入序列列转座座插入序序列的的复制制性转转座目录录转座子子(transposons)——可可从一一个染染色体体位点点转移移到另另一位位点的的分散散重复复序列列。转座子子组成成：反向重重复序序列转座酶酶编码码基因因抗生素素抗性性等有有用的的基因因IRIRTransposaseGene有用基因（二））转座座子转转座由转座座子介介导的的转座座目录录第二二节节重重组组DNA技术DNARecombinationTechnique重组DNA技术术的发发展史史年G.J.Mendel的豌豌豆杂杂交试试验1944年年O.T.Avery的的肺炎炎球菌菌转化化实验验1973年年美美国国斯坦坦福大大学的的科学学家构构建第一个个重组DNA分子子1977年年美美国国南旧旧金山山由博博耶和和斯旺旺森建建立世世界上上第一家家遗传工工程公公司，，专门门应用用重组组DNA技技术制制造医医学上上重要要的药药物。。1980年年开开始始建造造第一家家应用重重组DNA技术术生产产胰岛岛素的的工厂厂1997年年英英国国罗林林研究究所成成功的的克隆隆了多莉相关概概念DNA克隆隆工具酶酶目的基基因基因载载体基本原原理重组DNA技术术与医医学的的关系系本节主主要内内容一、重重组DNA技术术相关关概念念克隆(clone)来自同同一始始祖的的相同同副本本或拷拷贝的的集合合。获取同同一拷拷贝的的过程程称为为克隆化化(cloning)，即无性繁繁殖。（一））DNA克隆隆技术水水平：：分子克克隆即即DNA克克隆细胞克克隆个体克克隆（（动物物或植植物））DNA克隆隆应用酶酶学的的方法法，在在体外外将各各种来来源的的遗传传物质质（同同源的的或异异源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））与载载体DNA接合合成一一具有有自我我复制制能力力的DNA分子子———复制制子，，继而而通过过转化化或转转染宿宿主细细胞，，筛选选出含含有目目的基基因的的转化化子细细胞，，再进进行扩扩增提提取获获得大大量同同一DNA分子子。也也称基因克克隆或或重组组DNA。生物技技术工工程:基因工工程、、蛋白白质工工程、、酶工工程、、细胞胞工程程等目的①分分离获获得某某一感感兴趣趣的基基因或或DNA②获获得感感兴趣趣基因因的表表达产产物（（蛋白白质））基因工工程(geneticengineering)——实实现现基因因克隆隆所用用的方方法及及相关关的工工作称称基因因工程程，又又称重组DNA工艺艺学。（二））工具具酶限制性性核酸酸内切切酶DNA聚合合酶ⅠⅠ逆转录录酶T4DNA连接接酶碱性磷磷酸酶酶末端转转移酶酶TaqDNA聚合合酶重组DNA技术术中常常用的的工具具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核核酸内切切酶定义限制性核核酸内切切酶(RE)是识别DNA的特特异序列列,并并在识别别位点或或其周围围切割双双链DNA的一一类内切切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用与甲基化化酶共同同构成细细菌的限限制-修修饰系统统，限制制外源DNA，，保护护自身DNA。。分类Ⅰ、Ⅱ、、Ⅲ（基因工工程技术术中常用用Ⅱ型））第一个字字母取自自产生该该酶的细细菌属名名，用大大写；第二、第第三个字字母是该该细菌的的种名，，用小写写；第四个字字母代表表株；用罗马数数字表示示发现的的先后次次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血血杆菌d株的第三三种酶Ⅱ类酶识识别序列列特点——回文结构构(palindrome)切口：：平端切口口、粘端切口口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口同功异源源酶来源不同同的限制制酶，但但能识别别和切割割同一位位点，这这些酶称称同功异源源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制制性内切切酶虽然然识别序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，，产生相相同的粘粘性末端端，称为为同尾酶。这两个个相同的的粘性末末端称为为配伍未端端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA基因组DNA目的基因①分离获得得某一感兴趣趣的基因或DNA②获得感兴兴趣基因的表表达产物（蛋蛋白质）（四）基因载载体定义为携带目的基基因，实现其其无性繁殖或或表达有意义义的蛋白质所所采用的一些些DNA分子子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外外源DNA序序列被扩增而而特意设计的的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外外源DNA序序列可转录翻翻译成多肽链链而特意设计计的载体称为为表达载体。载体的选择标标准能自主复制；；具有两个以上上的遗传标记记物，便于重重组体的筛选选和鉴定；有克隆位点（（外源DNA插入点），，常具有多个个单一酶切位位点，称为多多克隆位点；；分子量小，以以容纳较大的的外源DNA。1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞胞内独立自主主复制；带有有某些遗传信信息,会赋赋予宿主细胞胞一些遗传性性状。目录λ噬菌体DNA改造系统统λgt系列（（插入型，适适用cDNA克隆）EMBL系列列（置换型，，适用基因组组克隆）2.噬菌体体(phage)M13噬菌体体DNA改造造系统（含lacZ基因因）M13mp系系列pUC系列M13噬菌体体pUC系列列的物理图谱谱3.粘性质质粒(cosmid)酵母人工染色色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载载体（如腺病毒，，腺病毒相关关病毒，逆转转录病毒）其他二、重组DNA技术基本本原理克隆基本过程目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的基基因的获取1.化学合合成法要求：已知目目的基因的核核苷酸序列或或其产物的氨氨基酸序列。。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章章）*1、化学学合成法获取取目的基因由已知氨基酸酸序列推测可可能的DNA序列组织或细胞染染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分分子含重组分子的的转化菌限制性内切酶酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细细胞内由克隆隆载体所携带带的所有基因因组DNA的的集合*2、从基基因组DNA文库获取目目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*3、从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录（二）克隆载载体的选择和和构建（三）外源基基因与载体的的连接1.粘性末末端连接方式：(1)同一限限制酶切位点点连接(2)不同限限制酶切位点点连接配伍末端连接接非配伍末端连连接BamHⅠ切割反应应

GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切切位点连接目录BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切切位点（配伍伍末端）的连连接配伍末端的连连接情况和同同一限制酶切切位点连接相相似。不同限制酶切切位点（非配配伍末端）的的连接EcoRⅠ切割位点点BglⅡ切割位点点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体目录2.平端连连接适用于：限制性内切酶酶切割产生的的平端粘端补齐或切切平形成的平平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3.同聚物物加尾连接在末端转移酶酶(terminaltransferase)的作用下，在在DNA片段段末端加上同同聚物序列、、制造出粘性性末端，再进进行粘端连接接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接接头(linker)连接由平端加上新新的酶切位点点，再用限制制酶切除产生生粘性末端，，而进行粘端端连接。人工接头及其其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌（从大肠杆菌菌K-12改改造）限制酶和重组组酶缺陷处于感受态导入方式转化转染感染（四）重组DNA导入受受体菌（五）重组体体的筛选1.直接选择法(1)抗药性标记选选择(2)标志志补救(markerrescue)(3)分子子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学学方法如免疫化学方方法及酶免检检测分析等(插入失活法法)抗药性标记选选择目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油油磷酸脱水酶基因因促进组氨酸合合成λDNA重组体标志补救目录α互补目录α互补的检检测目录原位杂交目录Southern印迹目录鸡的β肌球蛋蛋白的克隆和和检出目录重组DNA技技术操作过程程可形象归纳纳为小结结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组组DNA技技术术操操作作的的主主要要步步骤骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录录表达达体体系系的的建建立立表达达载载体体的的构构建建受体体细细胞胞的的建建立立表达达产产物物的的分分离离纯纯化化（六六））克克隆隆基基因因的的表表达达1.原原核核表表达达体体系系（E.coli表表达达体体系系最最为为常常用用））标准准：：选择择标标志志强强启启动动子子翻译译调调控控序序列列多多接接头头克克隆隆位位点点E.coli表表达达体体系系的的不不足足不宜宜表表达达真真核核基基因因组组DNA不能能加加工工表表达达的的真真核核蛋蛋白白质质表达达的的蛋蛋白白质质常常形形成成不不溶溶性性包包涵涵体体(inclusionbody)很难难表表达达大大量量可可溶溶性性蛋蛋白白大鼠鼠胰胰岛岛素素原原cDNA的表表达达和和分分泌泌目录录优点点：：可表表达达克克隆隆的的cDNA及及真真核核基基因因组组DNA可适适当当修修饰饰表表达达的的蛋蛋白白质质表达达产产物物分分区区域域积积累累缺点点：：操作作技技术术难难、、费费时时、、经经济济转染染———将表表达达载载体体导导入入真真核核细细胞胞的的过过程程方法法：：磷酸酸钙钙转转染染DEAE葡葡聚聚糖糖介介导导转转染染电穿穿孔孔脂质质体体转转染染显微微注注射射2.真真核核表表达达体体系系酵母母、、昆昆虫虫、、乳乳类类动动物物细细胞胞表达达载载体体pFASTBACI的的物物理理图图谱谱目录录目录录（一一））疾疾病病基基因因的的发发现现与与克克隆隆根据据基基因因定定位位克克隆隆之之并并研研究究其其性性质质，，而而认认识识疾疾病病的的分分子子机机制制。。三、、重重组组技技术术与与医医学学的的关关系系（二二））生生物制制药药重组组DNA医医药药产产品品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子