XXXX胶体金快速免疫诊断技术

ColloidalGoldLateral-FlowDiagnosticTechnology

胶体金免疫层析快速诊断技术------闵微，研发部快速检测快速检测是一种廉价的、一次性的、基于膜的检测方法，它能提供分析物存在于液体样品的视觉证据。这种检测可以以独立的试纸条，也可以以装在塑料盒中的形式进行。总的来说，做此项检测至少需要200ul的液体标本，可在2至5分钟内完成。在临床检测中，样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液，它们同样可以直接应用膜试纸条检测。这种检测方法无需仪器操作，可应用于临床、实验室、室外或者家庭——通常为无操作经验人员使用。2快速膜检测需求广泛，可应用于诸多领域（见下表）。随着灵敏度和特异性的提升，大量的潜在应用可能是作为替代昂贵仪器检测方法的低成本选择。34为何使用金标记早期的快速检测使用有色胶乳形成可视信号，目前的某些检测仍使用此手段。过去和现在，乳胶法一直是凝集反应主要的标记方法，这是因为它在结合成分的存在下易于凝集。对于快速检测而言，交联物的稳定性是避免假阳性的关键，而易于凝集可能就是其产生假阳性的主要问题。因为具有更好的潜在稳定性，20世纪80年代末，金标记被引入膜快速检测中。在适当的生产条件下，任何被精确大小的金颗粒都可以被重现性制造出来。不同的大小可用于不同的用途。其优良的稳定性、敏感性、精确性及可重复生产性等特点使得金适合于在快速检测中的应用。金本性属惰性元素，被适当加工可形成完整的球形颗粒。当正确连接时，蛋白质能牢固地结合在金颗粒表面，无论是液态或固态都能保持长久的稳定性。而且，若是在制造过程中蛋白被精确固定，其与金交联物的非特异性结合可被减至零。56胶体金技术起源及现状起源1971年,Faulk和Taytor引入

7原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。8现状层析法(Lateral-Flow)渗滤法(Through)免疫金银染色法胶体金的作用:

指示剂910与常规诊断方法相比优点缺点快速：全部检测过程仅需3-10分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低

可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。

稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。

检测标本种类多：既可用于查血，又可用于检尿或唾液，因而适合各种检查定量问题灵敏度问题11技术应应用类别应用领域检测的物质人类医学各级医院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,兽瘟疫等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食品安全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素12胶体金金层析析法一个快快速检检测的的底层层一般般是硝硝酸纤纤维素素膜，，在它它上面面固定定了了检测测蛋白白，通通常是是抗体体或抗抗原。。连连接着着膜的的是包包含有有干燥燥金标标的金金标垫垫（通通常是是玻璃璃纤纤维））。对对于目目前大大多数数可做做的检检测项项目，，这种种结合合垫含含有吸吸附了了针对对待检检分析析品品的特特异性性抗体体或抗抗原的的金金粒子子。样样品垫垫通常常为纸纸质质，附附着着着结合合垫。。当使使用样样品品垫时时，液液体样样品通通过毛毛细细扩扩散作作用穿穿移过过结合合垫垫，再再水化化金交交联物物，使使待分分析析样品品与交交联物物相互互作用用。。然后后金交交联物物与待待分析析样样品复复合物物转移移至膜膜条带带上再再移向向蛋白白结合合物，，复合合物在在此处处被固固定后后以一一条细细细细的红红线的的形式式产生生明显显的信信号。。第二二条线线是控控制线线，由由余下下的金金交联联物形形成于于膜膜上，，表明明测试试完成成。13试纸条条组成成结构构测试线线（（T线）控制线线（C线）胶体金金垫吸水滤滤纸样品垫垫NC膜（硝硝酸纤纤维素素膜））层析方方向PVC底板14层析法法技术术优势势:简单\现场\快速1.打开包包装取取出试试纸条条2.直接插入待待测样品中中3.目测读出结结果（3-10分钟内）15免疫层析法法检测原理理分类介绍绍

（双抗抗体夹心））（以HCG检测为例））16免疫层析法法检测原理理分类介绍绍

（竞争争反应）（以吗啡检检测为例））17免疫层析法法检测原理理分类介绍绍

（应用用proteinA金标）（以HIV检测为例））胶体金渗滤滤法将蛋白质抗抗原直接点点样在硝酸酸纤维膜上上，在硝酸酸纤维膜下下垫有吸水水性强的垫垫料，即为为渗滤装置置。在加抗抗原（抗体体）后，迅迅速加抗体体（抗原）），再加金金标记第二二抗体，由由于有渗滤滤装置，反反应很快，，在数分钟钟内即可显显出颜色反反应。此方方法已成功功地应用于于人的免疫疫缺陷病病病毒（HIV）的的检查和人人血清中甲甲胎蛋白的的检测。18胶体金银染染色法胶体金银染染色法（Dot－IGS／IGSS））是将斑点点ELISA与免疫疫胶体金结结合起来的的一种方法法。将蛋白白质抗原直直接点样在在硝酸纤维维膜上，与与特异性抗抗体反应后后，再滴加加胶体金标标记的第二二抗体，结结果在抗原原抗体反应应处发生金金颗粒聚集集，形成肉肉眼可见的的红色斑点点，此称为为斑点免疫疫金染色法法（Dot－IGS）。此反反应可通过过银显影液液增强，即即斑点金银银染色法（（Dot－－IGS／／IGSS）。1920胶体金免疫疫层析系统统技术路线21技术路线胶体金制备备技术标记技术NC膜与溶液喷喷点胶体金垫与与溶液喷点点样品垫吸水纸粘性底板干燥方法溶液体系分分析装配\切条\包装胶体金的制制备22制备原理所有的生产产方法都都是使用还还原剂提供供电子给溶溶液中带带正电荷的的金离子而而产生金金原子，如如下所示：：氯金酸＋还还原剂＝胶胶体金HAuCl4+e–=Au0通常使用的的还原剂包包括柠檬檬酸钠、黄黄磷、硼氢氢化钠、硫硫氰酸钠钠。2324根据不同的的制备方法法，可以制制备出直径径1－500nm的胶胶体金粒子子，但做为为免疫标记记探针，其其直径应在在3-30nm范围围内。在氯化金（（HAuCl4）水溶液中中加入还原原剂使之还还原并聚积积形成胶体体金粒子。。使用不同同种类、不不同剂量的的还原剂，，可以控制制所产生的的粒子大小小。即粒子子大小取决决于反应溶溶液中最初初还原试剂剂和还原核核的数量。。还原剂浓浓度越高，，核浓度也也越高，氯氯化金的还还原也就从从更多的还还原中心开开始，因此此产生的胶胶体金粒子子数量越多多，但体积积也越小。。粒子直径径每增加一一倍，数量量减少为原原来的1/8。25以柠檬酸钠钠和单宁酸酸做还原剂剂，能够制制备大小相相对一致、、直径3～16nm的胶体体金。因此此一般胶体体金探针均均使用该方方法进行。。但该方法法制备的胶胶体金粒子子直径范围围较窄，而而且残留的的多聚单宁宁酸残基往往往干扰某某些蛋白与与金粒子的的结合。此此时在溶液液中添加0.1～0.2％的的H2O2能够去除这这些残基。。双标记或或制备5-10nm的胶胶体金时建建议使用该该方法。利用柠檬酸酸为还原剂剂，可以制制备12～～150nm直径径的胶体金金。但制备备大体积的的胶体金时时，胶体金金粒子的误误差也同时时增加。因因此做单标记时，，建议使用用该方法制制备12-16nm直直径的胶体体金。除了上述方方法外，也也可以用磷磷作为还原原剂来制备备5nm的的胶体金，，它避免了了单宁酸残残基的问题题，但所形形成的金粒粒子体积变变化较大。。磷易燃且且有毒，制制备的残液液需进一步步处理，故故该方法已已经很少使使用。26白磷还原法法制备5nm胶胶体金取250ml三角瓶瓶一个，加加79ml双蒸水水，1ml1%氯化金，，并用0.25MK2CO3将溶液调至至中性（pH7.0）。取0.2ml饱和和磷/乙醚醚溶液加到到1.5ml试管管中，再加加0.8ml乙醚醚，混匀。。取0.7ml加加入溶液（（1）中(磷有毒且且易燃，操操作请带手手套，多余余的磷溶液液用CuSO4进行中和)。室温下轻轻轻摇匀15min，然后加加热沸腾并并保持5min，，自然冷却却。27单宁酸/柠檬酸钠钠法制备3～16nm胶体体金取一250ml三角瓶瓶，加入79ml双蒸水和和1ml1％氯氯化金，预预热至60～70℃。取一50ml烧杯，加加入4ml1％％柠檬酸钠钠，然后根根据所制备备金粒子体体积大小加加入不同用用量的单宁宁酸及等量量的25mMK2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保保持溶液的的中性pH。因此此如果单宁宁酸的量少少于0.5ml时时，对pH的影响不不大，K2CO3可以省略。。将上两种溶溶液迅速混混合并充分分混匀，加加热至沸并并保温10分钟。。自然冷却却。28柠檬酸钠（ml）单宁酸（ml）胶体金（nm）45000342000445006412084701041016柠檬酸三钠钠法制备12-30nm胶胶体金(Frens,1973)取250ml三角瓶瓶一个，加加100ml双蒸蒸水及1ml1%氯化金金，加热沸沸腾；取不同量的的1%柠檬檬酸钠加入入上述溶液液中。混匀匀，再保持持沸腾30min，溶液颜颜色首先变变黑，再逐逐渐变红，，粒子体积积较小时，，溶液呈桔桔红色，而而粒子体积积较大时，，则颜色偏偏向紫色。。29柠檬酸钠(ml)胶体金(nm)5 124 163 242.830制备高质量量胶体金的的注意事项项（1）玻璃器器皿必须彻彻底清洗，，最好是经经过硅化处处理（1％％双氯硅烷烷/氯仿浸浸泡1小时时，烘干））的玻璃器器皿，或用用第一次配配制的胶体体金稳定的的玻璃器皿皿，再用双双馏水冲洗洗后使用。。否则影响响生物大分分子与金颗颗粒结合和和活化后金金颗粒的稳稳定性，不不能获得预预期大小的的金颗粒。。（2）试剂剂配制必须须保持严格格的纯净，，所有试剂剂都必须使使用双馏水水或三馏水水并去离子子后配制，，或者在临临用前将配配好的试剂剂经超滤或或微孔滤膜膜（0.45µm））过滤，以以除去其中中的聚合物物和其它可可能混入的的杂质。（3）配制制胶体金溶溶液的pH以中性（（pH7.2）较好好。（4）氯金金酸的质量量要求上乘乘，杂质少少。最好是是进口的。。（5）氯金金酸配成1％水溶液液在4℃可可保持数月月稳定，由由于氯金酸酸易潮解，，因此在配配制时，最最好将整个个小包装一一次性溶解解，暂时不用用的可以用用1.5ml试管分分装为1ml保存存（-20℃）。30由于使用试试剂质量及及其它方面面可能存在在的误差，，以及制备备过程中的的其它问题题，胶体金金粒子的大大小及一致致性与理论论值可能有有偏差，因因此，在制制备完成后后必须进行行镜检。如如出现粒子子体积偏差差太大，粒粒子凝聚，，粒子边缘缘不清晰等等问题，须须重新制备备。胶体金溶液液最好保存存在4℃冰箱中；；也可保存存在室温下下，一般可可保存1-2个月月。但决不不可保存在在0℃以下，否否则金粒子子发生凝聚聚。31蛋白-金复合体体的制备32必须了解蛋蛋白与胶体体金持久结结合的物理理及化学进进程，仅仅仅把交联物物揉合到一一起，虽虽然成本低低廉且简易易，却通常常会导致聚聚集体的形形成。一种好的交交联物表现现为蛋白吸吸附于金的的表面上，，与胶乳不不同的是，，蛋白是被被动地吸吸附于交联联物表面，，因而不会会出现共价价结合。33一般认为胶胶体金粒子子表面为一一层AuCl2，因此，粒粒子表面带带有负电荷荷，这种负负电荷粒子子之间相互互排斥，形形成稳定悬悬浮的胶体体金溶液。。金颗粒表面面可以包被被一层生物物大分子（（如蛋白））来稳定和和保护这些些粒子，以以免受外来来电解质的的影响而相相互凝聚在在一起。胶胶体金粒子子对蛋白的的吸附作用用取决于pH值，这这是因蛋白白的净电荷荷取决于溶溶液的pH值，在pH=pI时为中性性。由于在在pH=pI时蛋白白溶解度最最小，因此此这时它水水化程度最最小，最溶溶液吸附到到疏水的金金粒子表面面。但在实实际的胶体体金探针制制备中，一般胶体金金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白白带正电，，有利于结结合更稳定定。在接近蛋白白质的等电电点或偏碱碱的条件下下，二者容容易形成牢牢固的结合合物。如果果胶体金的的pH值低低于蛋白质质的等电点点时，则会会聚集而失失去结合能能力。除此此以外胶体体金颗粒的的大小、离离子强度、、蛋白质的的分子量等等都影响胶胶体金与蛋蛋白质的结结合。34蛋白通过以以下机制于于几秒之内内吸附于于金表面金粒子所带带负电荷与与蛋白内内氨基酸（（如赖氨酸酸）所带带阳性电荷荷的最初的的相互吸吸引蛋白通过某某些氨基酸酸残基包包括色氨酸酸与金粒子子表面之之间的疏水水吸附作用用蛋白中的半半胱氨酸的的硫基与金金粒子间的的配价结合合35金颗粒大小小的选择检测信号是是由金颗粒粒聚集于测测试线或控控制线而出出现的信号号。这些粒粒子必须足足够大到到能被看见见，粒子的的尺寸越大大，这些些粒子聚集集后就越容容易被看见见。随着粒子尺尺寸的增大大，位阻现现象又成成了一个问问题。此外，这些些粒子的尺尺寸越大，，它们在既既定体积溶溶液中存在在的数量越越小。这种可见度度的需要与与位阻现象象之间的矛矛盾现象表表明，对于于大多数的的免疫检测测应用而而言，最适适的粒子大大小是40nm。在某些情情况下当位位阻现象成成为较大问问题时（（如针对较较小的抗原原），20nm的粒子则更更为合适；；当希望出出现更深颜颜色或当分分子表面较较低的曲率率提高了抗抗原抗体分分子间的交交互作用，，较大一点点的粒子则则更为可取取。应该由实验验决定确定定多少颗粒粒大小能带带来高灵敏敏度、浅背背景色和高高稳定性。。3637蛋白必须要要经过前处处理（1）去除高高浓度的盐盐分，高浓浓度的盐分分往往干扰扰蛋白与胶胶体金的吸吸附结合，，或导致胶胶体金粒子子的凝聚，，这一步往往往采用低低浓度缓冲冲液中进行行。（2）使蛋蛋白分子尽尽量分散为为单体，冻冻干蛋白或或高浓度蛋蛋白溶液中中蛋白分子子往往凝聚聚为多聚体体大分子，，可同时与与多个胶体体金粒子结结合，影响响标记的灵灵敏度和定定量分析。。（3）使蛋蛋白具有适适当的分子子量。蛋白白分子量过过小（30kD）），形成的的金-蛋白复合合体往往是是不稳定，，可短时间间内失活。。而分子量量过大时，，被认为影影响金-蛋白复合合体的灵敏敏度，特别别是已知蛋蛋白的结构构与活性中中心的情况况下，去除除对活性武武影响的结结构部分是是提高标记记灵敏度，，延长金-蛋白复合合体寿命（（防止凝集集）的有效效办法。把把分子量过过小的蛋白白与其它蛋蛋白（如BSA，牛牛血清蛋白白等）结合合后，能制制备出稳定定性更佳的的金-蛋白复合合体。3839抗体Antibody来源差异:鼠抗,兔抗和羊抗抗种类差异:单抗,多抗腹水的处理理:饱和硫酸铵铵沉淀法特异性:亲和层析柱柱浓度:浓缩溶解液:不含盐,例如PB抗原抗体生生物原料抗原Antigen偶联抗原物物质:BSA,OVA等毒品检测来来源:合成抗原待标记蛋蛋白溶液液的制备备将待标记记蛋白预预先对0.005Mol/LpH7.0NaCl溶溶液中4℃透析过过夜，以以除去多多余的盐盐离子，，然后100000g4℃离心1h，去去除聚合合物。40确定胶体体金与蛋蛋白结合合的最佳佳pH值对于理化化性质不不确定的的蛋白这这一步尤尤为重要要。过量量的蛋白白与不同同pH值值得胶体体金结合合后，只只有某一一特定pH值能能够形成成结合最最稳定的的金-蛋白复复合体。。在高浓浓度电解解质（如如NaCl）作作用下不不会凝聚聚。不同同蛋白的的适宜pH范围围的宽窄窄大不相相同。一一般选择择最小适适宜pH值为最最佳pH值。但但有些金-蛋白复复合体的的实际情情况并不不完全如如此，最最稳定金-蛋白复复合体并并不完全全代表活活性最好好。这要要靠实验验验证。。这里需要要特别指指出的是是，使用用不同直直径的胶胶体金与与同一蛋蛋白结合合时，除除了蛋白白量完全全不同外外，往往往最佳pH也有有一定变变化。41由于胶体体金溶液液可能损损坏pH计的的电板，，因此，，在调节节pH时时，采用用精密pH试纸纸测定为为宜。由于盐类类成分能能影响金金溶胶对对蛋白质质的吸附附，并可可使溶胶胶聚沉，，故致敏敏前应先先对低离离子强度度的水透透析。必必须注意意，蛋白白质溶液液应绝对对澄清无无细小微微粒，否否则应先先用微孔孔滤膜或或超速离离心除去去。一般情况况下应避避免磷酸酸根离子子和硼酸酸根离子子的存在在，因为为它们都都可吸附附于颗粒粒表面而而减弱胶胶体金对对蛋白质质的吸附附。42蛋白质最最适用量量的选择择加入蛋白白质的量量不足以以稳定胶胶体金的的各管，，均呈现现出由红红变蓝的的聚沉现现象；而而加入蛋蛋白量达达到或超超过最低低稳定量量的各管管仍保持持红色不不变。以以稳定1ml胶胶体金溶溶液红色色不变的的最低蛋蛋白质用用量，即即为该标标记蛋白白质的最最低用量量，在实实际工作作中，可可适当增增加10％～20％。。能够形成成稳定金-蛋白复复合体的的蛋白的的最小量量。如果果在制备备金-蛋白复复合体时时加入太太多的蛋蛋白，不不仅造成成浪费，，而且更更为严重重的是容容易造成成金-蛋白复复合体凝凝聚，并并严重影影响标记记活性。。因为金-蛋白复复合体溶溶液中的的游离蛋蛋白容易易抢先与与标记位位点结合合，起到到“封闭闭”（Blocking）作作用，而而标记蛋白白标记不不上。在在标记位位点希少少、被标标记物含含量较少少的情况况下要特特别注意意。43胶体金标标记蛋白白的纯化化超速离心心法：根根据胶体体金颗粒粒的大小小，标记记蛋白的的种类及及稳定剂剂的不同同选用不不同的离离心速度度和离心心时间。。凝胶过滤滤法：此此法只适适用于以以BSA作稳定定剂的胶胶体金蛋蛋白结合合物的纯纯化。将将胶体金金蛋白结结合物装装入透析析袋，在在硅胶中中脱水浓浓缩至原原体积的的1/5～1/10。。再经1500r/min离心20min。取取上清加加至SephacrylS-400（丙丙烯葡聚聚糖凝胶胶S-400））层析柱柱分别纯纯化。4445NC膜与溶液液喷点---NC膜NC膜的性能能NC膜的选择择爬速(135秒/4cm)对灵敏度度的影响响底衬的作作用不同膜厂厂家的产产品差异异(Whatman/S&S,Millipore,Sartorius)46NC膜与溶液液喷点---喷点溶液液Dispensing(喷点演示示:BIODOTXYZ系列喷点点仪器)C\T线溶液前前处理:1.过滤,0.2um孔径滤膜膜2.离心1万转10分钟喷点过程程头尾去除除,喷点中的的报废标标志C\T线喷点工工艺(BJQ3000喷头)与接触划划点(FL1000XY喷头)工艺比较较4748胶体金垫垫与溶液液喷点胶体金垫垫1.材料选择择2.糖的作用用3.缓冲溶液液的作用用喷点法与与浸泡法法的比较较(AJQ3000喷头)49样品垫材料选择择各成分的的作用1.缓冲溶液液的作用用(PH)2.盐的作用用3.大分子蛋蛋白BSA\PVP4.表面活性性剂Tween-20,TritonX-10050吸水纸吸水效率率纸的差异异51粘性底板板原理作用用供应商的的选择52干燥方法法Dry干燥方法法的比较较1.冷冻干燥燥法2.烘箱3.烘房温湿度的的控制1.温度对蛋蛋白的影影响2.湿度的控控制办法法53溶液体系系分析各环节缓缓冲溶液液的选择择与统一一盐的作用用表面活性性剂的作作用糖的作用用大分子蛋蛋白的作作用其他作用用物质54装配\切条\包装装配切条(演示:BIODOTCM4000切条机)刀的维护护与清洁洁底板选择择(胶的影响响)包装55发展方向向56标记技术术的探索索顺磁粒子子标记、、量子点点标记免疫反应应信号转转化为电电子信号号模式57新的层析析模式58生物传感感器59Thanks!9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。1月-231月-23Wednesday,January4,202310、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。23:54:5323:54:5323:541/4/202311:54:53PM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。1月月-2323:54:5323:54Jan-2304-Jan-2312、故人江海别别，几度隔山山川。。23:54:5323:54:5323:54Wednesday,January4,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2323:54:5323:54:53January4,202314、他乡生白白发，旧国国见青山。。。04一月月202311:54:53下下午23:54:531月-2315、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。。一月2311:54下下午1月-2323:54January4,202316、行动出成果果，工作出财财富。。2023/1/423:54:5323:54:5304January202317、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。11:54:53下午午11:54下下午23:54:531月-239、没没有有失失败败，，只只有有暂暂时时停停止止成成功功！！。。1月月-231月月-23Wednesday,January4,202310、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。23:54:5323:54:5323:541/4/202311:54:53PM11、成功功就是是日复复一日日那一一点点点小小小努力力的积积累。。。1月-2323:54:5323:54Jan-2304-Jan-2312、