光化学传感器理论与实践第七章优秀课件

光化学传感器理论与实践第七章第一页，共七十三页，2022年，8月28日第七章生物修饰传感器第一节识别原理第二节基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节核酸生物修饰传感器第二页，共七十三页，2022年，8月28日第一节识别原理

生物修饰传感组成：由内传感器(普通光学波导传感器或化学修饰光化学传感器)和修饰的生物敏感层组成。

第三页，共七十三页，2022年，8月28日

识别原理：在生物修饰传感器中，修饰的生物敏感层在对分析对象进行生物识别的同时，能向普通光学波导传感器或化学修饰光化学传感器提供可检测的光学信号。第四页，共七十三页，2022年，8月28日

特点：与分子或离子化学识别相比，生物识别有更高的选择性与灵敏度。

第五页，共七十三页，2022年，8月28日具有生物识别功能的生物物质

生物修饰敏感层目前应用：生物修饰敏感层主要涉及酶，抗原或抗体。酶微生物抗原或抗体激素抗体结合蛋白植物凝血素第六页，共七十三页，2022年，8月28日酶相关知识酶的定义：是一类具有催化活性的蛋白质分子。活性基团种类：组氨酸上的咪唑基、丝氨酸上的羟基、半胱氨酸上的巯基等酶特点(优点)非常高的催化效率非常高的特异性影响酶活性因素环境因素：pH值影响(最佳：生理pH7.4),抑制剂(Ag+、Hg2+、As3+等)存在使酶失活活性中心的空间构象：独特的三维结构决定了酶发挥其活性的基础第七页，共七十三页，2022年，8月28日

酶分子上的亲核基团有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。蛋白质中三种主要的亲核基团第八页，共七十三页，2022年，8月28日全酶的结构与分子组成全酶酶蛋白活性中心辅助因子蛋白链第九页，共七十三页，2022年，8月28日底物

活性中心以外的必需基团结合基团

催化基团

活性中心

多肽链图7-1酶活性中心示意图底物敏感链第十页，共七十三页，2022年，8月28日类别功能举例氧化还原酶促进电子或氢转移葡萄糖氧化酶转移酶促进化学基团转移转氨酶水解酶促进水解反应蛋白、淀粉酶裂解酶促进消去反应形成双键碳酸酐酶异构酶促进同分异构体的相互转变磷酸葡萄糖变化酶连接酶促进键的形成，同时使ATP分子中的高能磷酸键断裂谷氨酰胺合成酶酶的分类第十一页，共七十三页，2022年，8月28日目前主要限于：氧化还原酶，转移酶。原因：常常伴随有可供光学检测的物质的产生或消耗;可直接采用普通光学波导传感器作为内传感器器件;有时酶所催化的化学反应可能不产生或不消耗可供检测的物质，但往往伴随有易于被化学修饰光化学传感器检测的物质（例如H＋、O2、NH3等）的生成与消耗。酶在光化学传感器中应用第十二页，共七十三页，2022年，8月28日酶分化反应速率方程(一)

E+SESP+E

(酶)(底物)(中间物)(产物)(酶)K1K-1K1葡萄糖(S)己糖激酶(E)复合物(ES)诱导契合作用例如：第十三页，共七十三页，2022年，8月28日酶分化反应速率方程(二)稳态近似法：米氏方程(一):

米氏方程(二):

第十四页，共七十三页，2022年，8月28日光学波导内传感器生物催化层底物产物酶图7-2酶催化光化学传感器识别原理底物产物样品检测器光极第十五页，共七十三页，2022年，8月28日识别过程传质扩散底物(分析对象)：样品相生物催化层产物：生物催化层样品相

稳态响应信号：产物生成速度恰好等于产物离开生物层的净速度。分析对象浓度测定根据校正曲线+稳态响应信号(快响应)根据校正曲线+反应速率(响应时间较长)第十六页，共七十三页，2022年，8月28日免疫反应免疫反应：当动物体收到外界异性物质（抗原）的侵入时，动物体内的免疫系统细胞就会产生一种与这些异性物质相对抗的物质（抗体），通过抗体与抗原的结合使抗原的作用消失。第十七页，共七十三页，2022年，8月28日免疫反应抗原：具有免疫原性与抗原特异性。按来源可分为天然抗原、人工抗原和合成原。一般为具有较大分子量的生物活性物质，例如蛋白质、多糖、核酸等，有时为小分子活性物质(半抗原)，药物，激素，肽等。第十八页，共七十三页，2022年，8月28日免疫反应抗体：是一类称为免疫球蛋白的蛋白质。五种免疫球蛋白包括IgG(主要)、IgA、IgM、IgD、IgE。第十九页，共七十三页，2022年，8月28日-COOH端-NH2端图7-3IgG分子结构示意图结合抗原碎片Fab可结晶碎片Fc重链（heavychain，H链）450～550个氨基酸残基，分子量约55～75kD。根据Ig重链抗原性的差异，Ig可分为五类即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，相应H链为γ、μ、α、δ及ε链。第二十页，共七十三页，2022年，8月28日五种免疫球蛋白结构示意图第二十一页，共七十三页，2022年，8月28日抗体与抗原的结合力非极性作用氢键力作用库仑力作用分子间吸引力立体排斥力通过-NH2-OH作用通过非极性侧链作用通过两侧链相反电荷吸引通过范德华力作用通过结合部电子云互补抗原-抗体结合力的主要贡献者抗体识别抗原分子的基础第二十二页，共七十三页，2022年，8月28日免疫光化学传感器响应免疫光化学传感器响应特点：与热力学平衡有关第二十三页，共七十三页，2022年，8月28日免疫光化学传感器响应抗原抗体检测无需标记：抗原-抗体结合前后会引起体系荧光强度或偏振程度的变化而直接被检测。需标记：无光学性质变化，进行荧光标记。或第二十四页，共七十三页，2022年，8月28日降低抗原-抗体结合力提高光化学传感器的可逆性措施1.减少主体溶剂极性降低抗体－抗原之间的疏水相互作用从而降低抗原与抗体结合力(消极，因为：结合力发、灵敏度下降)2.通过改变测量温度降低结合力的方法(消极)3.通过缓释技术，或竞争结合原理可以作成可逆响应的光化学传感器(积极)第二十五页，共七十三页，2022年，8月28日第七章生物修饰传感器第一节识别原理第二节基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节核酸生物修饰传感器第二十六页，共七十三页，2022年，8月28日第二节基于普通光学波导传感器

的酶催化传感器概念：当酶催化反应直接产生或消耗可供光学检测的物质时，可将相应的酶固定于普通光学波导传感器的探头上，构成酶催化传感器。第二十七页，共七十三页，2022年，8月28日第二节基于普通光学波导传感器

的酶催化传感器类型(根据检测信号分)紫外吸收荧光(NADH体系

)化学发光(Luminol)第二十八页，共七十三页，2022年，8月28日探测光纤信号光纤尼龙网碱性磷酸脂酶+404nm样品+酶钨灯例：基于碱性磷酸酯酶的普通光化学传感器基于紫外吸收信号检测的酶催化传感器对-硝基苯基磷酸盐对-硝基酚滤光片404.7nmPMT公共端Anal.Chem.1985,57,565第二十九页，共七十三页，2022年，8月28日基于荧光信号检测的酶催化传感器基本上是与辅酶I(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，NAD)参加的反应联系在一起NAD结构式第三十页，共七十三页，2022年，8月28日关于辅酶I分子生物学意义：是参与生命体中能量代谢过程的重要物质，在反应中主要起递氢作用。辅酶I类型还原型(NADH)：荧光较强

lEx=360nm,

lEM=460nm氧化型(NAD)：无荧光第三十一页，共七十三页，2022年，8月28日分析对象固定化酶催化反应文献乳酸、丙酮酸卤酸脱氢酶乳酸+NAD丙酮+NADH﹝7，8﹞葡萄糖葡萄糖脱氢酶葡萄糖+NAD葡萄糖酸内酯+NADH﹝9﹞胆酸羟基类固醇脱氢酶3-羟基胆酸+NAD胆酸酮+DADH﹝10﹞乙醇醇脱氢酶乙醇+NAD乙醛+NADH﹝7，11﹞苹果酸、草酸盐苹果酸脱氢酶苹果酸+NAD草酸盐+NADH﹝12﹞甘油-3-磷酸葡糖-6-磷酸-脱氢酶甘油-3-磷酸+NAD6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADH﹝12﹞3-羟基-丁酸3-羟基-丁酸脱氢酶3-羟基-丁酸+NAD乙酰乙酸+NADH﹝12﹞辅酶I醇脱氢酶乙醇+NAD乙醛+NADH﹝12﹞睪酮雄（甾）酮羟基类固醇脱氢酶睾酮雄（甾）酮+NAD类固醇+NADH﹝12﹞表7-3检测NADH荧光的脱氢酶催化传感器第三十二页，共七十三页，2022年，8月28日与NADH生成反应耦合NADHNAD++心肌黄酶与NADH反应产生更强荧光产物刃天青(无荧光)9-羟基异吩噁唑(强荧光)灵敏度提高2倍2.与NADH反应产生紫外可见吸收NADHNAD++噻唑蓝紫色甲臜强吸收lmax=558nm

心肌黄酶第三十三页，共七十三页，2022年，8月28日硫胺素+H2O2HRP基于其它荧光体系的酶催化传感器基于辣根过氧化酶(HRP)催化硫胺素的H2O2荧光传感器：HRP结构示意图意义：是继酶催化NADH荧光传感器之后另一种非常有意义的酶催化荧光传感器检测H2O2本身；可检测在酶催化反应中生成H2O2的生物活性物质(底物)硫胺荧(强荧光)+二硫化硫胺素(无荧光)第三十四页，共七十三页，2022年，8月28日基于化学或生物发光信号检测的酶催化传感器该传感器的显著特点：体系只需要通过光学波导器件收集信号光，可直接将生物催化层修饰在光电检测器上。基于化学或生物发光的酶催化反应体系鲁米诺(Luminol)+H2O2化学发光体系(最经典)ATP-荧光素-O2-荧光素酶生物发光体系NADH-黄素单核苷酸(FMN)-氧化还原酶-O2-荧光素酶生物分化发光体系第三十五页，共七十三页，2022年，8月28日鲁米诺(Luminol)+H2O2化学发光体系许多氧化酶催化的反应伴随有H2O2产生，将氧化酶与过氧化酶固定在一起可建立灵敏的化学发光酶催化传感器，用于检测底物，如：尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、胆固醇、胺类、丙酮酸等。第三十六页，共七十三页，2022年，8月28日ATP-荧光素-O2-荧光素酶生物发光体系ATP+荧光素+O2AMP+氧化荧光素+PPi+CO2荧光素酶hn(lmax=560nm)应用：检测ATP，DL=10-10molL-1其它有ATP参与的代谢过程所涉及的反应物由Blum等人提出(Anal.Chim.Acta,1989,227,387)

第三十七页，共七十三页，2022年，8月28日NADH-黄素单核苷酸(FMN)-氧化还原酶-O2-荧光素酶生物催化发光体系NADH+H++FMNNAD+FMNH2氧化还原酶FMNH2+RCHO+O2FMN+RCOOH+H2O荧光素酶hn(lmax=490nm)第三十八页，共七十三页，2022年，8月28日应用测定辅酶I(NADH)：

C.Haggertyet.al.,Anal.Biochem.,88,162(1978)检测其它底物：与相应底物脱氢酶耦合后，参与递氢作用的辅酶I起指示物质的作用L.J.Blumet.al.,Anal.Lett.,21,717(1988)第三十九页，共七十三页，2022年，8月28日第七章生物修饰传感器第一节识别原理第二节基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节核酸生物修饰传感器第四十页，共七十三页，2022年，8月28日第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四十一页，共七十三页，2022年，8月28日技术产生背景

有些酶催化的反应不产生或不消耗可直接光学检测的物质，但涉及质子的产生与消耗、氧气的产生与消耗、酸性或碱性气体(CO2或NH3)产生与消耗。这些物质很容易被化学修饰光化学传感器所检测，故可采用相应化学修饰光化学传感器作内传感器构建酶催化传感器。第四十二页，共七十三页，2022年，8月28日常用的内传感器种类氧光化学传感器为内传感器；CO2光化学传感器为内传感器；NH3光化学传感器为内传感器。第四十三页，共七十三页，2022年，8月28日氧光化学传感器为基础光极的酶催化传感器传感器的结构与原理：以测量葡萄糖为例第四十四页，共七十三页，2022年，8月28日葡萄糖样品光学波导O2敏感荧光试剂葡萄糖葡萄糖酸氧化酶葡萄糖酸O2O2O2气透膜生物催化层探测光激发信号光发射尼龙网+图7-5氧光化学传感器为基础光极的葡萄糖生物传感器内传感器氧光学传感器第四十五页，共七十三页，2022年，8月28日传感器的特性样品中葡萄的浓度越大，传感器的荧光强度信号越大；检测范围0.1~20mmol/L；响应时间几分钟之内。第四十六页，共七十三页，2022年，8月28日氨气酶光极传感器为基础传感器的酶催化传感器传感器的结构与原理：以测量尿素为例NH2CONH2(尿素)+H2O2NH3+CO2脲酶第四十七页，共七十三页，2022年，8月28日底物样品光学波导底物NH3脱氨酶NH3气透膜生物催化层探测光信号光图7-6以氨气酶光极为基础传感器的酶催化传感器内传感器氨气敏光极NH3酶支持膜HINDH+IND-+NH4+H++化学修饰层厚度(m)第四十八页，共七十三页，2022年，8月28日传感器的特性尿素的浓度越大，产生的NH3气越多，使内感器的吸收或荧光信号变化越明显；检测范围5×10-5~1×10-2

mol/L，DL=5×10-5

mol/L；响应时间约7分钟。第四十九页，共七十三页，2022年，8月28日第七章生物修饰传感器第一节识别原理第二节基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节核酸生物修饰传感器第五十页，共七十三页，2022年，8月28日第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五十一页，共七十三页，2022年，8月28日1.体系:一一对应的免疫体系；适用范围2.抗原抗体要有荧光活性：有内源荧光的抗体（或抗原）：许多抗体或抗原的多肽链含有荧光活性的氨基酸残基础，如：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。第五十二页，共七十三页，2022年，8月28日荧光标记后的抗体（或抗原）对标记物的要求：

(1)稳定；(2)荧光发射光谱与背景荧光有明显差别；(3)高荧光量子产率；(4)大的Stokes位移；(5)有合适的与抗原或抗体连接的法；(6)不影响抗原-抗体结合反应。第五十三页，共七十三页，2022年，8月28日

主要基于抗原-抗体作用前后荧光强度的变化：非辐射荧光能量转移：荧光熄灭

例：半抗原2,4-二硝基苯(DNP)DNP-赖氨酸+抗体→DNP-赖氨酸/抗体(有荧光活性)(无荧光活性)简单免疫荧光分析原理第五十四页，共七十三页，2022年，8月28日辐射荧光能量转移：荧光增强例：二甲氨基萘-5-磺酰(DANS)DANS-赖氨酸+抗体→DANS-赖氨酸/抗体(有荧光活性)(强荧光活性)荧光强度增加25-30倍抗原抗体结合前后微环境变化引起荧光增强度变化第五十五页，共七十三页，2022年，8月28日构建基于简单免疫体系的光化学传感器1.采用荧光标记物的简单免疫体系构造光化学传感F.V.Brightetal.,Anal.Chem.,62,1065(1990)第五十六页，共七十三页，2022年，8月28日光纤端部HSA：人血清白蛋白Fab：抗人血清白蛋白抗体碎片荧光试剂：丹酰氯Fab

与HSA结合后使荧光标记物的微环境改变，荧光增强KSCN溶液能将Fab与HSA分开，从而使传感器再生。第五十七页，共七十三页，2022年，8月28日2.酶联免疫光化学传感T.Vo-Dinhetal.,Appl.Spectrosc.,40,696(1986)非荧光物质：与磷酸根相结合的4-甲基伞形酮与抗体结合的酶：碱性磷酸酯酶酶催化分解产物：4-甲基伞形酮酶，强荧光活性第五十八页，共七十三页，2022年，8月28日EEEEEEEE激发发射酶催化反应固定在池壁上的待测抗原非荧光酶底物E酶联抗体酶催化产生的荧光活性物质激发态的荧光活性物质图7-9酶联免疫荧光传感器原理示意图第五十九页，共七十三页，2022年，8月28日定量分析的依据：样品中抗原浓度越大，结合酶联抗体就越多，催化水解产生的游离4-甲基伞形酮越多，强荧光强度越强。第六十页，共七十三页，2022年，8月28日第七章生物修饰传感器第一节识别原理第二节基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节基于简单免疫体系的光化学传感器第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节核酸生物修饰传感器第六十一页，共七十三页，2022年，8月28日第五节基于竞争免疫体系的光化学传感器第六十二页，共七十三页，2022年，8月28日原理：Optode-Ag+Ab*+AbOptode-Ag-Ab*+Optode-Ag-AbOptode-Ab+Ag*+AgOptode-Ab-Ag*+Optode-Ab-Ag或样品中待测Ag(或Ab)越多，结合到光极探头上的标记物抗原Ag*(或标记抗体Ab*)越少，传感器的荧光强度越低。第六十三页，共七十三页，2022年，8月28日有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器J.S.Schultzetal.,DiabetesCare,5,245(1982)第一个真正有可逆响应的免疫光化学传感器。所有基于荧光标记竞争的免疫体系均可以按此设计思想制成有可逆响应的光化学传感器。第六十四页，共七十三页，2022年，8月28日激发发射葡萄糖荧光素标记的葡聚糖固定化刀豆球蛋白激发态荧光素标记葡聚糖样品光纤渗析管图7-11有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器第六十五页，共七十三页，2022年，8月28日基于荧光能量转移的竞争免疫传感器原理：当对抗原和抗体标记不同荧光物质时，若一个标记物的荧光发射光谱与另一个标记物的荧光吸收光谱重叠则抗原与抗体结合的同时可能发生荧光能量转移。第六十六页，共七十三页，2022年，8月28日hnhn标记1标记2AgAb能量转移Ag-Ab荧光能量转移的结果：一个标记物的荧光消失，另下标记物的荧光能量增强。荧光能量转移图示第六十七页，共七十三页，2022年，8月28日应用1.测葡萄糖：Schultzetal.,Talanta,35,145(1988)Ag：葡聚糖(半抗原)；标记物：荧光素异硫氰酸酯(FITC)。Ab：刀豆球蛋白A；标记物：罗丹明(Rh)。葡萄糖浓度↑，游离的Ag-FIT