高三理化生培养基

试验三常用培育基的制备、灭菌与消毒试验目的：了解培育基的配制原理并且驾驭配制培育基的一般方法和步骤

培育基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的养分基质原则:目的明确;养分协调;限制pH、渗透压等条件;经济节约方法：查阅文献;细心设计;试验比较

步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查

培育基种类:一、按成份的不同划分自然培育基、合成培育基、半合成培育基二、按培育基的物理状态划分固体培育基、液体培育基、半固体培育基三、按培育基用途划分基础培育基、加富培育基、鉴别培育基、选择培育基

牛肉膏蛋白胨培育基牛肉膏蛋白胨培育基是一种应用最广泛和最一般的细菌基础培育基。其配方如下：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2(后调)高氏1号培育基高氏1号培育基是用于分别和培育放线菌的合成培育基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。查氏合成培育基查氏合成培育基是用来分类和培育霉菌的培育基,其配方如下：NaNO33g,K2HPO41g,KCl0.5g,MgSO4.7H2O0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g,水1000mL,pH自然麦芽汁培育基用来培育酵母菌,干麦芽粉加4倍水,在50-60℃保温糖化3-4小时，运用碘液试验检查,至糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过滤，调pH为6.0。消毒与灭菌消毒：歼灭病原菌和有害微生物的养分体灭菌：杀灭一切微生物的养分体，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加热、过滤、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。加热法：干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170℃）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培育皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。3、留意事项：1）培育基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度限制在<180℃；3）物品不能太挤；4）温度降至70℃时才开箱门。湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质简洁凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法：1、设备：高压灭菌锅2、时间长短依据灭菌物品的种类和数量不同有所变更。3、适用于培育基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。4、留意事项：1）冷空气彻底解除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。在运用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的解除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同重量空气时，压力与温度的关系见表2常压蒸汽灭菌：

对于不宜用高压蒸汽灭菌的培育基如明胶培育基、牛乳培育基，含糖培育基等可接受此法。彻底灭菌则接受间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min，超高温杀菌135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。优点：保持食品价值和养分成分。

过滤除菌：

原理：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围：很多材料如血清、抗生素及糖溶液接受此法。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点：不破坏培育基成分，只适用少量滤液。留意事项：1、压力适当；2、无菌条件下进行；3、防止渗透现象。辐射灭菌：

原理：紫外线波长在200－300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸取；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。缺点：穿透力不大。距照射物<1.2m为宜。应用：无菌室，医院。留意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。

化学药品灭菌：

原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。留意：与药品的浓度凹凸，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等

分别与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。为什么要进行纯培育：平板上的单一菌落并不确定保证是一种菌。常用的分别、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法稀释混合平板法、平板划线法试验四微生物的分别、纯化及培育技术稀释涂布平板法：步骤：1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培育基，高氏I号培育基，查氏培育基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培育基倒4皿，高氏I号培育基和查氏培育基各倒3皿。2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。3、涂布：将上述每种培育基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最终三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。4、培育：高氏I号和查氏倒置培育于28℃培育箱中培育3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培育基在37℃培育1-2days。5、挑菌落：转至斜面，检查是否一样，保存。

平板划线法：1、倒平板，标记培育基名称，编号和试验日期。2、划线方法稀释混合平板法：1、先加菌2、倒平板时留意培育基温度3、混合匀整微生物培育技术1、斜面接种2、液体培育基接种3、穿刺接种将已接种的斜面、半固体和液体培育基放置培育箱中培育将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。视察菌落形态并记录序号来源大小形态边缘颜色表面代谢物种类试验五：放线菌及霉菌形态视察目的要求1.了解放线菌、霉菌的形态视察的原理。2.学习并驾驭视察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。放线菌是一群丝状，G+的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pH与细菌相像。主要以孢子方式进行无性繁殖。其DNA碱基组成中GC含量特殊高。超过任何已知的细菌。很多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。

放线菌(Actinomycetes)分生孢子丝琼脂表面基内菌丝气生菌丝Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基内菌丝）andaerialmycelium（气生菌丝）withchainsofconidiospores（分生孢子）分生孢子丝琼脂表面基内菌丝气生菌丝Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基内菌丝）andaerialmycelium（气生菌丝）withchainsofconidiospores（分生孢子）放线菌生长到确定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相像，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。链霉菌的各种孢子丝结构链霉菌的分别：pH中性偏碱喜干（含水少）接受含各种无机盐的选择性培育基已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效有50多种被实际应用Antibiotics放线菌Actinomycetes

霉菌(molds)是丝状真菌的总称,即“发霉的真菌”。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下大量生长繁殖。形态特征（Morphologicalcharacteristics）属异养型真核生物，具有丝状或管状结构，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状结构称为菌丝体。养分菌丝（vegetativemycelium）：吸取养分气生菌丝（aerialmycelium）繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。分类（classification）有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞，菌丝内有很多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。nonseptate(2)septate繁殖方式无性繁殖：芽生孢子节孢子孢囊孢子后垣孢子分生孢子有性繁殖：卵孢子接合孢子子囊孢子Sporangiospores

孢囊孢子（Sporangiosporesareformedwithinasporangium）节孢子Arthrospores分生孢子Conidiospores卵孢子（Oospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOosporesformation接合孢子Zygospores接合孢子形成过程子囊孢子Ascospores几种常见霉菌属主要特征分布作用与用途根霉属菌丝无隔,单细胞迅速蔓延,有假根,孢子囊呈黑色,产生孢子囊和接合孢子常长在淀粉类食品上如馒头、面包、甘薯等能将淀粉转化为糖，用于生产糖化酶，酿造甜酒等曲霉属菌丝分隔，分生孢子梗顶端膨大，顶囊上生辐射状小梗菌落疏松、颜色多样空气、谷物、土壤和各种有机物上分解淀粉和蛋白质能力强，用于制曲、制醋、生产柠檬酸、酶制剂及糖化饲料等青霉属菌丝分隔，孢子梗呈扫帚形，菌落由紧密到疏松，多呈蓝绿色空气、土壤及物品上，腐烂的柑橘上更多青霉素产生菌，也用于制备农用抗生素和发酵饲料根霉根霉的形态结构曲霉曲霉的形态结构左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具有二层小梗青霉青霉的形态结构A单轮型B非对称型C对称二轮型试验内容人们设计了各种培育和视察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本试验接受插片法。插片法:

倒平板→插片→接种→培育→镜检→记录绘图压印法:

倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图埋片法:

倒琼脂→切槽→接种→培育→镜检→记录绘图倒平板

将培育基熔化后，倒10-12毫升左右于灭菌培育皿内，凝固后运用.

插片

将灭菌的盖玻片以45度角插入培育皿内的培育基中，插入深约为1/2或1/3。接种与培育

用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培育3～7天。视察

培育后菌丝体生长在培育基及盖玻片上，当心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝风光 对的载玻片，压放于载玻片上。干脆在显微镜下视察。

关键步骤及留意事项

倒平板要厚一些，接种时划线要密。插片时要有确定角度并与划线垂直。视察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜视察。假如用0.1%美蓝对培育后的盖玻片进行染色后视察，效果会更好。试验六、菌种保藏几种常用的保藏方法：1、传代培育法保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培育基（用于厌氧细菌）培育好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培育、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。2、载体法使生长合适的微生物吸附在确定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。3、悬液法将细菌、酵母菌细胞悬浮在确定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4、冷冻法使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。留意限制降温速率及疼惜剂的运用。5、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不须要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。操作方法

1、斜面保藏法将菌种转接在适宜固体斜面培育基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，一般细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简洁、运用便利，缺点是保藏时间短、易被污染。2、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法好用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，一般细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接种方式培育菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。4、砂土管保藏法

（1）河砂处理取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最终一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（２）土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。(3)砂土混合处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或依据须要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)匀整后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左