清华物理学课件-生物物理

俺怎么越看越象乒乒乓乓，不要扔西红柿～～～-_-b俺们的进山全家福，hohoCOOHNH2每一种离子的分布都满足Boltzmann分布函数第i种离子densityprofile:(x)i=ie-Zie(x)/kT接近表面处(x=0)：oi=ie-Zieo/kT其中：Zi为第i种离子的离子价(x):

electrostaticpotentialatxo为表面电势(x=0处的(x))e为电子电荷i为第i种离子的体浓度7.生物膜的离体研究生物膜的离体研究脂单层方法支撑脂双层方法平面脂双层(黑脂膜)方法脂质体方法脂单分子层技术Langmuir膜

兼性分子在空气与水的界面上形成的单分子层。Langmuir-Blodgett(LB)膜

气/液界面单层膜转移到固体表面上形成的薄膜(单层或多层)。典型的能形成LB膜的分子：硬脂酸分子(兼性分子)的结构及模型空气水脂单分子层技术Langmuir膜的铺展将要铺展单层膜的兼性分子溶于适当的易挥发性有机溶剂中，滴加在适当的亚相上，待有机溶剂挥发掉以后，在亚相表面就悬浮着一层兼性分子。脂单分子层技术气液界面上Langmuir膜制备装置示意图脂单分子层技术LB膜制备装置示意图垂直提拉法制备LB膜将单层膜保持在一定的压力下，用事先处理好的固体载片沿着垂直方向缓慢地伸入和提拉出亚相，单层膜就会被连续地转移到固体表面上。疏水衬底提拉(左)妾水衬底提拉(右)水平提拉法制备LB膜

将表面经过疏水化处理的载片水平地放在亚相表面，使单层膜吸附转移到载片表面。脂单分子层技术表面压由于气/液(如水)界面单分子层的存在，使液相的表面张力由0

降低为

，定义表面压为=0-脂单分子层技术单层膜的-A曲线在等温条件下改变膜太平的挡片的位置，并记录的变化。以对分子的平均面积作图，得到单层膜的曲线(等温线)。单分子层-A曲线(等温线)示意图G:气相(二维理想气体状态方程：A=kT)L-G:气相-液相共存L:液相(状态方程：

(A-Ao)=kT)M:凝胶相-液相共存S:固相

由于单分子层除了层内分子间的相互作用外还有层内分子与底部亚相中的液体分子之间的相互作用，这就使得单层膜可能出现一些中间状态，与这些中间状态相似的三维空间的相态至今还未发现过。Idealizedisothermsofpressure()versusarea(A)relationshipofphospholipidmonolayersshowingdifferentphasesandcoexistenceregions.Pressure-AreaisothermsofmonolayersofDPPConwateratthetemperaturesindicated.使用单层膜检测A40的插膜单层膜检测A40与A28插膜的比较单层膜检测胆固醇对A40插膜的影响单层膜检测A40插膜的膜组分依赖性脂单分子层技术表面收集法测量界面蛋白浓度原理图Wang等人设计了一套真空吸取的办法(BiophysicalJ.83(2002)985-993)，待荧光标记的蛋白达到插膜平衡之后，将部分单层膜连同粘着的体相溶液收集，然后通过荧光强度的测量确定界面蛋白浓度。

倒置式荧光显微膜天平的结构原理示意图

脂单分子层技术荧光显微镜膜天平技术观测脂膜的相分离和运动LB膜在生物学中的应用(1)脂类之间及脂类/蛋白之间相互作用的研究-A曲线，-t曲线，荧光显微膜太平

(2)配体与受体间的分子识别(3)膜的粘着与融合(4)蛋白质的二维结晶化(5)生物传感器和生物芯片Two-dimensionalcrystallizationofavidinonbiotinylatedlipidmonolayers生物膜的离体研究脂单层方法支撑脂双层方法平面脂双层(黑脂膜)方法脂质体方法固态支撑膜四种不同类型的固体表面支撑膜(A)支撑脂双层与固体表面间由一层约1nm厚度的超薄水层分隔；(B)支撑双层的内层与固体表面通过静电作用或共价键直接结合；(C)支撑双层与固体表面间由一层超薄的软多聚化合物分隔；(D)在固体表面先藕联上超薄的多聚物层（如dextran），然后再通过共价藕联将蛋白与多聚物结合在一起形成蛋白支撑膜。

制备支撑双水分子层的3种方法(1993)a)LB技术b)SUV在亲水衬底上融合c)SUV在疏水脂单层表面融合固态支撑膜固态支撑膜固体衬底表面生物功能化的方法如果要固定多聚物，如Dextran，可以先在表面上沉积一层带有功能头基（如环氧基，氨基，腈基）的长链表面活性剂单层膜和乙醇，乙醇的目的是使表面亲水化，以防非特异性的蛋白吸附。通过活化的酯（如琥珀酰胺），将其结合到脂质或聚合物链上，而蛋白上则化合上氨基，氨基与活化脂间结合将蛋白固定。这种方法很适合固定抗原表位或Fab片断。在镍或铜离子存在的情况下，NTA(Nitrilotriaceticacid)与寡聚组氨酸可以形成稳定的鳌合物。利用此原理，制备鳌合脂质NTA-lipid，在二价离子（如Ni2+,Cu2+）存在时鳌合脂质与含有寡聚Histine的蛋白能结合。

全内反射荧光技术Schematicillustrationofcontrolledassemblyofbiotin-lipidcontainingmonolayer/avidin/biotin-ssDNAcomplexonsolidsupport(a)andtherelatedSPRspectra(b).Supportedmembranesas“phantomcells”Incorporationofchargedlipids,gangliosides,andreceptorsintosupportedbilayersallowcontrolofelectrostatic,polymer-induced,andlock-keyforces(Science271(1996)43-48)

RICMvisualizationofaDMPCvesiclecontaining1mol%biotin-labeledlipidasthereceptorinteractingwithasurfacecoveredbystreptavidin.Theformationofadhesionplaquesiscausedbyinterplayofthestrongattractionbetweenreceptorsandtherepulsiveundulationforces.生物膜的离体研究脂单层方法支撑脂双层方法平面脂双层(黑脂膜)方法脂质体方法为什么叫“黑脂膜”？显微观察磷脂成膜情况Schematicrepresentationoftheexperimentalset-upfortheformationofBLMbypaintingafilmoflipidonaholeonTefloncup.测量参数：电阻电容制备BLM的脂溶液

为了要模拟生物膜的脂组分，故BLM是从需要模拟的组织器官提取磷脂或鞘脂的。用得较多的有从脑组织提取的脂，叶绿粒抽提物，胆固醇，氧化胆固醇以及纯的PC，PE，PS等。

BLM制备液一般应将高度纯化的磷脂溶于碳氢溶剂，例如癸烷，辛烷，苯，氯仿或乙醇等。有时也用鲨烯作溶剂，因为鲨烯会在BLM形成过程中被排挤出来，使BLM成为无溶剂的BLM。这种BLM更接近自然生物膜的基架。一般情况下溶剂碳氢链在C6一CI16间较适宜，它们在室温时都是液态，极少溶于水。BLM制备液中如含有杂质就不易铺制出BLM。

对称BLM的铺制

实验槽中间以聚四氯乙烯作为隔板（BLM支持物），隔板中间开一小圆孔，面积一般不要超过0.25平方厘米。

槽内放上适当的缓冲溶液，把小孔浸没。然后把一滴BLM制备液加到隔板的小孔下方（用毛刷或微量注射器）。由于聚四氯乙烯具有良好的亲脂疏水性，故脂较容易附在小孔四周，并扩展过整个小孔，随后脂滴的中间部分慢慢变薄，最后成为双分子层，而沿着小孔四周则积有较厚的脂层，成为一个圈，它对BLM起支持作用，这一圈称P－G边界（Plateau－Gibbsborder）。脂滴在小孔中形成双分子层脂膜是一个自发的渐变过程。通过光学或电学的方法可以验证双分子层是否已经形成。

毛刷法铺制对称BLM

TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonahydrophobicpartitionbyraisingtheleveloftheaqueousphaseonwhichamonolayerhasbeenformed.

不对称BLM的制备(1)由单层合成双层的BLM铺制法隔板固定而使两侧溶液液面移动的方法：使两个可以同步推进的注射器与聚四氟乙烯隔板两侧的溶液连通并使左右液面保持在同一水平上。同步推进注射器，使两侧液面升至小孔下方2－3毫米处。在两侧溶液面上分别滴加BLM制备液，BLM制备液在液面扩展为单分子层，此时再使二注射器同步推进，使二侧面上升经小孔而达小孔上方2－3毫米处方才停止。当二侧脂单层上升经过小孔时，合而形成脂双层。如果脂溶剂是易挥发的，这样形成的BLM还能做到不含脂溶剂。另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移动，但仍能保证左右两侧之间有良好的绝缘性。铺制时先将隔板向上提起，使小孔上升至液面之上，将BLM制备液分别滴在左右两侧的水面上．脂即在水面上扩展为脂单分子层。如果在两侧水面上铺展不同的脂，则两边的单分子层就不对称。然后将隔板向下移，当隔板的小孔移到液面下时，很自然地在小孔上就形成了双分子脂层。铺成的BLM并不是静止不动的，双层的脂分子是流动的，两侧不同的脂分子在P－G边界中会混合在一起，而P－G边界中的脂分子是会同双分子层中的脂分子通过流动而进行交换的，最后在BLM中的脂也就不可能保持不对称了。但是这种方法可以确保BLM两侧溶液不会混合，因而可以进行膜两侧溶液不对称时的各种研究。TheformationofBLMbyapposingtwomonolayersonthetipofamicropipettebyfirstremovingthetipfromtheaqueousphaseonwhichamonolayerispresent,andthenreinsertingthetipthroughthemonolayer.不对称BLM的制备(2)

在滤纸的微孔中形成BLM

在显微镜下观察滤纸，可以看到上面有许多微孔。有人把滤纸先用脂浸泡，然后取出晾干，这样滤纸就具有亲脂疏水特性。用这种脂处理过的滤纸放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯隔板（当然要有特别设计的夹具，把滤纸夹在左右二室之间）。然后用前面介绍的方法铺制BLM，实践证明在滤纸的许多小孔上都形成了BLM，只是每个BLM的面积小，但是许多小面积的BLM加起来就比单个“大”孔上铺成的BLM还大。生物膜的离体研究脂单层方法支撑脂双层方法平面脂双层(黑脂膜)方法脂质体方法Temperatureinducedshapechangesofvesicles(1990).

(a)Transitionofavesiclefromabiconcaveshape(center)toaninvaginated(stomatocyte)shape(leftside)atdecreasingtemperatureandtoabuddedshape(rightside)atincreasingtemperature.Shapesofvesicles(orcells)onthebasisofthebilayercouplinghypothesismodel(1983):Thedifferentcellshapescanbeexplainedintermsoftwoparameters:1)thereducedvolumev=v/vs:theratiooftheactualvolumeofthecelltothatofasphere,2)therelativeareadifference=(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s)

whereA0andAiaretheareasoftheouterandinnerleafletofthemembraneandwhereA0,sandAi,sarethecorrespondingvaluesofthesphere.Shapetransformationofgiantvesicletriggeredbytemperaturechanges.Thetransitionsarecompletelyreversible!

Phasecontrastmicrographsofshapechangeofcompositeshell(1998).

DMPCvesiclecontaining2Mofactin(imageaandb)and7M(imagecandd)ofactin.脂质体的类型：SUV：小单片层脂质体(smallunilaminar-)MLV：多片层脂质体(multilayer-)LUV:大单片层脂质体(largeunilaminar-)

脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭合囊泡。SUV(小单层囊泡)的制备(1)：

方法一：将磷脂用氯仿溶解，通氮气干燥，用真空泵或旋转蒸发器驱除残留溶剂。加入所需的水相，使脂质浓度在mM范围。之后，悬浮液在探头式或水浴式超声仪中超声至透明（温度视脂质而异，保持在相变温度以上，但过高温度时脂质易氧化）。用探头式时仅带几分钟，用水浴式则右时长达2小时。虽然用水浴式费时长，但此时超声可在充氮气的密闭容器中进行。用负染电镜术，可检验囊泡的大小，其直径下限可达20nm。实用中往往要加入胆固醇成分，此时直径至少50nm。SUV(小单层囊泡)的制备(2):

第二种方法是将脂质的乙醇溶液快速注入到缓冲液中，随即自发地形成SUV。脂质的最终浓度为3—30mM。所形成的囊泡直径范围为30-110nm，与脂质的浓度有关。这一方法的优点是避免了超声的损伤．且快速、简单及温和，但脂质体的浓度相当稀，需要进一步浓缩，另一个缺点是高浓度的乙醇必须由随后的纯化阶段去除。SUV(小单层囊泡)的制备(3):

方法三：将MLV的悬浮液以20，000磅／英寸的压力，4℃时通过French滤器挤排。四次挤排后，94％囊泡的大小范围为31.5－52.5纳米。该法所得囊泡较超声法的略大，能适用于各种脂质。此外，操作简单、重复性好，亦无超声损伤。MLV(多层囊泡)的制备(1)：

根据Bangham的方法:

在100毫升圆底烧瓶中，用氯仿溶解10毫克含5摩尔％PA的eggPC，通氮气去除氯仿，在烧瓶壁形成磷脂薄膜。将烧瓶置于真空中，过夜（或数小时）除去剩留的溶剂。然后加入所需的水溶液5毫升，脂质水化数小时（相变温度之上）。然后用旋涡混合器振摇，即得MLV的悬浮液。

MLV中各片层之间的间隔取决于VanderWaais吸引力和水化、静电的排斥力之间的平衡。生理盐浓度条件下，PC组成的MLV中各片层之间的间距约2.8纳米。脂质带负电时，间距增加（特别是在低离子强度时）。制备中加酸性磷脂(如PA)的道理就在于此。

MLV适于包囊各种物质，也适于各种脂膜。其制备法是所有脂质体制备中最简单的。缺点是大小分布很不均匀，包裹效率也不高。MLV(多层囊泡)的制备(2)：多层囊泡的脱水形成（脱水一再水化循环法)

0.1微摩尔磷脂用超声分散于1毫升水中。将待包裹的物质加入，通干燥的氮气将水分蒸发。在干燥的过程中，SUV被浓缩，彼此融合形成多片层的平板，因而将待包裹的物质夹在诸片层之间。干燥毕，把湿棉花塞入试管或通以含水汽的氮气流几小时以使脂质再水化。此时，多片层膨润，形成大的囊泡。从而俘获大部分的溶质。然后加入水，将混合物轻轻振荡以分散脂质囊泡。若再通过聚碳酸酯滤膜，则可分选大小。该方法的最大优点是包裹效率极高，对DNA分子能达50％（10毫克脂质包裹1毫克DNA)，也能有效地包裹蛋白质。制备过程中酶的活性仍保持近90％。此外，适用于几乎所有的磷脂。但该法易受水相中无机离子的影响，此外不太适用于包裹较小的分子。LUV(大单层囊泡)的制备(1):注入法将非极性溶剂中的脂质溶液在使溶剂能挥发的条件下注入到水溶液中，溶液中脂质即以薄膜的形式残留在气泡和液相的界面上。可以计算出，薄膜的组成仅是几个脂双层。当气泡通过水相上升时，片层分散后形成单片层的脂质体。最后用聚碳酸酯滤膜分选大小。具体方法：4毫升戊烷或乙醚的脂质溶液（1－2毫摩尔脂质）缓慢地注入到4毫升、60℃的水相中（0.2毫升／分）。水相中缓慢地通氮气泡以促使溶液混匀，同时给空气一溶液的界面上提供惰性环境、增加气泡的大小，从而有利于单片层囊泡的形成。注入完全后，将脂质体悬浮液通过聚碳酸酯滤膜以分选大小、去除凝聚体。然后，再用凝胶柱过滤（例如Sephadex。G－25或G－50，BiogelP－10）进一步去除残留的溶剂。注入法的好处是适用于各种脂质，而且在1小时内即可完成。主要的限制是最终的制剂相当稀（1一15毫摩尔），因而包裹效率低。该法能得直径为150－250纳米的LUV。LUV(大单层囊泡)的制备(2):反相蒸发法（REV）

Szoka等设计了另一种制备LUV的方法。该方法中，水一非极性溶剂混合液中的脂质分子形成内翻型微团，此时脂质的尾部插入非极性相，而头部基团包围水滴。当非极性溶剂在真空中蒸发后，微团彼此结合，形成大的单片层的囊泡。典型制备时，66微克分子（50毫克）脂质溶于3毫升乙醚，加入1毫升水相（PBS等缓冲液及待包物质），通氮气下水溶式超声2－5分，直至混合物变为清沏的一相悬浮液或均匀的乳白色液（超声后30分内水和油相不分离）。然后，移至旋转蒸器中，用水泵抽气驱除乙醚。当大部分溶剂除去后，悬浮液呈凝胶状，经2－3次旋涡振荡后再继续减压蒸发，直至得到均一的悬浮液．最后进过孔直径0.2微米的聚碳酸脂滤膜，即能得到大小校均匀的LUV。也可用透析或上Sepharose4B柱或离心等方法除去未包裹的物质及残留的有机溶剂。

REV法的优点是：1.水相的包裹容积大（水相离子强度低时，如0.01摩尔NaCI，能达65％）；2.能包裹大的生物高分子，如铁蛋白、25SRNA；3.制备过程中不受水溶性蛋白质存在的影响，也不受磷脂种类的影响；4.水相容积从02毫升至10毫升都可以处理。主要的缺点是待包物质暴露于有机溶剂中，且要经短时间超声，这样可能导致某些蛋白质的变性或DNA断裂。LUV(大单层囊泡)的制备(3):去垢剂稀释法将过量去垢剂(超过CMC)加入到膜悬浮液中直到因形成去垢剂-脂质-蛋白质的混合微团而变得澄清为止。此后缓慢降低去垢剂的浓度(如透析)，致使脂质与膜蛋白形成囊泡状膜结构，这样就能达到重组蛋白的作用。去垢剂如胆酸盐、TritonX－100等用于脂质体重组已取得很大成功。

现列举典型的去垢剂一LUV法：eggPC和脱氧胆酸盐混合成1毫升溶液（20微克分子脂质：10微克分子去垢剂）。水浴超声数分，最初的浑浊悬浮液即变为透明状（因混合微团的形成）。然后用凝胶过滤除去脱氧胆酸盐。囊泡的直径约100纳米，可认为是小的LUV。俘获容积为2－3升／摩尔。用该法已成功地包裹了细胞色素C和葡萄糖等。

去垢剂稀释法已广泛地应用于膜蛋白脂质体的重组。方法学上的限制是，透析时需几小时甚至几天才能完成；此外，如果被包裹的溶质能够通过透析膜，则包裹效率就非常低。LUV(大单层囊泡)的制备(4):SUV融合法1.钙促融合法Panahadjonoulos等将负电荷磷脂的SUV和Ca2＋混和，再用EDTA螯合Ca2＋。当Ca2＋与含PS的SUV相互作用时，囊泡首先凝聚形成沉淀，融合形成多片层结构。而后用EDTA去除Ca2＋时，该片层结构膨胀，形成大的单层囊泡。典型实验中，1－10毫摩尔不饱和PS用以制备SUV。加入足量的CaCI2，使Ca2＋／脂质之比为1：2。此时SUV沉淀。然后，加入稍过量的EDTA，搅拌直至沉淀物形成LUV的透明悬浮液。这样所形成的囊泡，能够在相当温和的条件下包裹诸如病毒、核酸及铁蛋白等结构。俘获容积约7升／摩尔，20毫摩尔脂质悬浮液中包裹效率约10－15％。2.冰冻一融化一超声法第二种融合方法是冰冻一融化一超声的方法。典型步骤是，30毫克脂质在1毫升缓冲液中超声形成SUV。然后加进待包物质。混合物在液氮中冰冻，然后再融化。冰冻一融化过程可根据情况一次或两次。再在水浴中超声30秒（超声目的主要是用以分散聚集体）。最终所形成的囊泡对离子不易通透，俘获容积约8升/摩尔。该方法的优点是简单且温和，且可用于膜蛋白重组。然而，在有蔗糖、高浓度离子或有二价阳离子存在时效果不好。Threemethodsforreconstitution.(1)Lipidandproteinssolubilizedindetergentsaremixedandthenthedetergentisremovedbydialysis,dilution,orgelfiltration.(2)Delipidatedproteinscansometimesbespontaneouslyincorporatedintoapreformedbilayer.(3)Partiallydelipidatedproteinswithasmallamountofdetergentssometimesformdiscsthatcanfusewithpreformedvesicles(胆酸盐法).重组脂质体right-side-outvesicles:0.5MNa2PO4and0.1MMg+.inside-outvesicles:0.5MNa2PO4.redbloodcell红细胞膜制备脂质体生物膜的离体研究脂单层方法支撑脂双层方法平面脂双层(黑脂膜)方法脂质体方法去污剂与膜的分离

对于生物膜结构与功能的研究，通常需要将膜解聚成各种组分。抽提分析膜脂，一般使用有机溶剂。对于膜蛋白，有机溶剂也是可以使用的，但是许多蛋白在有机溶剂中容易变性，沉淀。因此，要针对不同类型的膜蛋白选择不同的提取方法。溶解膜蛋白可以采用：螯合剂，改变离子强度和pH值，蛋白的变性剂（如脲、胍等），酶解等方法，但对于膜内在蛋白，上述方法分离效果都不好，只能采用去污剂抽提的方法。Methodsforsolubilizationofmembraneproteins.Stepsusuallyinvolvedaresaltwash(whichremoveselectrostaticallyboundproteins)followedbysonicationordetergenttreatment,orsolubilizationinanorganicsolvent.用去污剂溶解膜内在蛋白

搞清去垢剂溶解膜磷脂和膜蛋白的先后次序

Klingenberg实验室利用CAT(抑制剂)饱和的线粒体膜研究去垢剂对这种线粒体膜的作用机理。结果发现，去垢剂与蛋白的比例为1:1时，当膜上的磷脂约有50％被溶解后，才开始观察到CAT－蛋白复合体被溶解。因此，去垢剂对这种线粒体膜的作用，首先是磷脂被溶解，然后才是蛋白被溶解。由此可以设想，去垢剂单体分子首先“攻击”磷脂的双分子层，使脂的双分子层变成松散，然后才作用于CAT－蛋白复合体上。Detergent的单体与团粒在溶液中处于动态平衡状态。由于单体分子不断深入到磷脂双层中，使团粒不断解离成单体。当愈来愈多的去垢剂分子深入到脂双层而形成复合的磷脂－去垢剂团粒时，蛋白分子被包围，最后被溶解下来。需要了解去污剂的性质及其作用机理

纯化鉴定膜蛋白，使用去污剂是必须的。在使用去污剂溶解的过程中，膜被破坏，蛋白与脂双层以及细胞骨架之间的作用被去除，取而代之的是蛋白与去污剂之间的作用。蛋白被去污剂溶解后，膜蛋白就如同水溶性蛋白一样可被进一