生物化学与分子生物学进展-工具酶

分子克隆技术常用的工具酶基因重组基因组DNA目的基因PCR限制性内切酶目的基因基因载体重组体(复制子)基因重组工欲善其事，必先利其器核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶第一节限制性核酸内切酶5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶3’3’5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）电泳IIIIII限制性核酸内切酶

能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。切割不同来源的DNA分子，而产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。

存在于细菌体内。

一、限制酶概念提出的背景

20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其它Ecoli株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。

1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶.EcoliK株噬菌体EcoliK株其他Ecoli菌株限制现象限制性内切酶

能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。修饰与限制系统是细菌保护自身不受外来DNA入侵的防御系统NNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’二、限制性核酸内切酶的分类

自1968年首次从EcoliK株和β株中分离到限制酶，继后不断发现和分离到新的限制酶。仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年04月19日,REBASE(TheRestrictionEnzymeDatabase)收集的编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．

根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。

I类：系复合功能酶，即对双链DNA有切割、甲基化、解旋的活性不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。Ⅱ类：基因工程的工具酶。Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，对分子克隆操作亦无实用意义。I类限制酶由3个不同的亚基组成，这3个亚基分别由宿主特异DNAhsdS，hsdM，hsdR基因编码，反应条件需要Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸，系复合功能酶，即对双链DNA有切割、甲基化、解旋的活性，并有水解ATP的ATP酶活性。一般在识别位点外的400bp～7000bp进行非特异切割，产生非特异片段，不适用于基因工程。

I类限制酶只在肠道菌中发现。2个亚基组成，反应条件需要Mg2+和ATP，对双链DNA亦有切割和甲基化修饰功能，但无解旋酶和ATP酶活性，识别序列不对称。修饰时仅在识别序列的一条链上甲基化，另一条链没有甲基化。虽能在DNA链上的特异位点切割，但切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp～27bp，对分子克隆操作亦无实用意义。

Ⅲ类限制酶

Ⅱ类限制酶为单链多肽，反应条件只需Mg2+，对DNA的水解有很强的特异性。它要求严格的识别序列和切割位点，切割位点所要求的序列中有一个碱基的变异、缺失或修饰都不再能被水解。其中大多数可用于分子克隆，使得分子生物学的实验结果具有高度的精确性、可重复性，被誉为分子生物学家的手术刀。

Ⅱ类限制酶Ⅱ类限制-修饰系统的限制酶活性与甲基化酶活性分别是不同的酶。相对应的限制酶与修饰酶虽然识别DNA的同一序列，但从已知序列的50多对限制-修饰系统酶中，2种酶的氨基酸序列没有同源性；不同的Ⅱ类限制酶之间，除少数同裂酶外，亦没有同源性。

限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写,

第2，3二个字母取自来源细菌种名的头2个字母，小写,

如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示,如HindⅢ代表从流感噬血杆菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分离到的第3个限制酶。三、限制性核酸内切酶的命名原则1一般性状

分子质量为60kD，单链多肽，最适pH为6～8；对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用。2识别序列

它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4bp～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp。多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。四、Ⅱ类限制性核酸内切酶

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列3酶切切口

有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端；很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

AACNNNNN3’3‘NNNNNCAA

TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）AATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’4．贮存与应用

限制酶对热不稳定，贮存于-20ºC，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。

5限制酶的活性单位和质量评估

限制酶的活性单位是指在适当的条件下(通常为37℃，pH7.5～8.0，NaCl50mmol/L～150mmol/L，Mg2+5mmol／L～10mmol／L，反应体积为50μL)，1h内完全酶解1μg特定底物DNA(常用者为λDNA)的酶活性。6影响限制酶活性的因素1）“星”活性酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。

EcoRⅠ：GAATTC-----

EcoRⅠ*：AATT

酶浓度太高缓冲液的组成偏离(如用其他金属离子代替Mg2+、高pH或低盐)

有机溶剂(如乙醇、异丙醇、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙三醇)，反应液中甘油的终浓度高于5％尽可能使用能在相应时间内获得完全酶解的最少酶量减少反应体系中甘油的含量除Mg2+外不加其他重金属离子适当提高反应系统的离子强度尽可能除去反应系统中可能存在的有机溶剂，如沉淀DNA用的乙醇。2）甲基化识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。

限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会阻碍限制酶的酶解活性。受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。

所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。3）底物性状

随底物的不同而活性发生改变某些限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的活性有所不同。如EcoRI、PstI和SalI酶解超螺旋pBR322DNA时的用量比酶解同样量λDNA的用量至少需要增加5倍量的酶。

由于限制酶活性单位一般是用λDNA为底物确定的，因此，对非λDNA底物进行酶解时，最好作些预实验，以寻找最适酶用量的条件。

底物位点优势

有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率也有差异，称为底物位点优势。最常见的是HindⅢ对λDNA的消化产物中4.3kb带的荧光亮度常比2.3kb和2.0kb带还浅，显示HindⅢ对该片段位点的切割效率低于其他位点，表现出位点优势效应。此效应于1975年已被发现，但其机制尚未阐明，①与不同位点上碱基的甲基化修饰有关，②可能与识别序列外的DNA空间结构或某种化学修饰有关。4）试剂：缓冲系统

必须用有足够缓冲能力的缓冲液以维持反应最终的适当pH

。

Tris缓冲系统是最广泛应用和不利因素最少的，但其温度系数大，其pH亦可受浓度的影响，稀释时须重测pH；反应pH大于9时，常选用甘氨酸缓冲系统；要求pH6.0～7.5时，磷酸缓冲液是个好的缓冲系统，温度系数小，但磷酸缓冲液仅用于后续的酶促反应不受磷酸根离子抑制的系统，如磷酸盐会抑制末端标记和连接反应；通常的酚抽提和乙醇沉淀不能有效地去除磷酸根离子；能络合Mg2+的柠檬酸盐和其他生物缓冲试剂不宜使用。5）限制酶活性不良的可能原因及解决措施

酶已失活，反应体系中有抑制剂存在，缓冲液组成或反应温度不适，

DNA已甲基化、未甲基化或其他修饰，

DNA的纯度未达到，底物中没有所选酶的识别序列，电泳凝胶的浓度不适，等等。7限制片段末端的连接作用5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’8特殊性质的限制酶1)可变酶其识别序列一般不止6bp，且识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如BstⅨ的识别序列及切割方式为：

5’……CCANNNN↓NTGG……3’3’……GGTNNNN↑NACC……5’

2)ⅡS类限制酶又称远距离裂解酶(Distantcleavage)

这类酶的识别序列为不对称的4bp～7bp，切割位点在识别序列外确定的lbp～20bp.

切割位点在识别序列两侧以括号内的数字注明。由于其切割位点特殊性，致使其在基因工程中具有一定的应用价值。

3)双切割酶如Bsp24l的识别序列为:(8/13)GACNNNNNNTGG(12／7)，序列两端括号内的数字表示切割位点在标出链的识别序列5’-端上游第8位碱基、3’-端下游第13位碱基处，以及在互补链识别序列的5’-端上游第12位碱基、3’-端的下游第7位碱基处双切割.

4)同裂酶(issochizmer)

亦称为异源同工酶，是从不同菌种分离到的不同的酶，但它们的识别序列相同，切割方式可以相同也可以不相同。如HapⅡ与MspI的识别与切割序列均相同.第二节甲基化酶

能识别限制酶识别的序列，并把其中的某些碱基甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰)，属修饰酶类。经修饰的DNA不再被限制酶降解。已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示。如M．EcoRI是能使EcoRI识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶

识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至少有3种：

①敏感的，甲基化后不能再切割；②不敏感的．甲基化后仍可切割；③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。第三节与DNA合成相关酶类一、大肠杆菌DNA聚合酶I1三种酶活性1）DNA聚合活性dTTP5'5'

ATGCAATTGC3'||||3'TAC

GT5’5’引物5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTATCGAC5’?3’5’外切酶活性

5’3’外切酶活性能切除突变的DNA片段能辨认错配的碱基对，并将其水解GC2）核酸外切酶活性二、Klenow酶1:随机引物标记核酸探针2:5’-粘端补平或3’端标记3:合成cDNA的第二链4:DNA序列分析5:3’-端的末端标记小片段N端C端木瓜蛋白酶大肠杆菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow酶）DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性三、逆转录酶逆转录mRNADNA以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。1975年，H.TeminRNA病毒:劳斯鸡肉瘤病毒放线菌素D(-)(-)DNA合成RNA