第3章消毒灭菌与病原微生物实验室安全

第3章消毒灭菌与病原微生物实验室生物安全主讲人：《中华医学检验全书》主编北华大学临床微生物学教授海南医学院特聘教授

李影林

2010年9月目的要求掌握：消毒、灭菌、抑菌、防腐、无菌的概念；巴氏消毒法的方法和温度；高压蒸气灭菌的方法和温度；紫外线灭菌的原理和特点；化学消毒剂的杀菌机制。熟悉：湿热灭菌的优点；真空干燥法保存菌种的方法；化学消毒剂的种类。病原微生物的分类；病原微生物实验室的分级；实验室感染的控制、监督和法律责任。了解：干热灭菌的方法；滤过除菌法的原理和方法；超声波消毒法的原理；各种化学消毒剂的作用特点和适用范围；影响消毒和灭菌效果的因素。第一节消毒灭菌的常用术语消毒（disinfection）灭菌（sterilization）防腐（Antisepsis）无菌（Asepsis）无菌操作(antiseptictechnique)消毒（disinfection）是指杀死物体上或环境中的病原微生物，但不一定能杀死含芽胞的细菌和非病原微生物的方法。用以消毒的药品称为消毒剂（disinfectant）。灭菌（sterilization）是指杀灭物体上所有微生物，包括病原微生物和非病原微生物、细菌的繁殖体和芽胞的一切方法。防腐（Antisepsis）是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时为防腐剂。无菌（Asepsis）不含活菌的意思。防止细菌进入人体或其他物品的操作技术，称为无菌操作。进行微生物学实验、外科手术、医疗操作等过程，均需要严格的无菌操作，以防止污染和感染。第二节消毒灭菌的方法物理消毒灭菌法化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法是用化学药品进行消毒灭菌的方法热力灭菌法辐射杀菌法滤过除菌法超声波杀菌法干燥与低温抑菌法热力灭菌法

焚烧和烧灼：是一种彻底的灭菌方法。微生物实验时，接种环和试管口可通过火焰烧灼灭菌。干烤法：160～170℃，维持2～3h，可杀灭一切微生物包括芽胞。红外线:波长0.7～

1000μm的电磁波,其中以波长1~10μm

者热效应最强。其热效应只能在照射到的表面产生。灭菌作用与干热相似。干热灭菌湿热灭菌高压蒸气灭菌法(autoclaving)是一种最常用、最有效的灭菌方法。煮沸法：103.4kPa，100℃5min，杀死细菌繁殖体。流动蒸气消毒法（常压蒸气灭菌法）：蒸笼间歇灭菌法：反复多次的流动蒸气消毒法巴氏消毒法（pasteurization）一、物理消毒灭菌法在灭菌温度和时间相同的情况下，以湿热灭菌法效果为佳①湿热条件下，菌体吸收水分，使菌体蛋白质易于凝固变性。

②湿热蒸气的穿透力比干热空气强、故能较快提高灭菌物品内部的温度。

③热蒸气与被灭菌的物品表面接触时气态变为液态，放出大量潜热，能迅速提高灭菌物品的温度。高压蒸气灭菌法[高压蒸气灭菌器]

是一个密闭的蒸锅，锅内蒸气压力愈大，温度也随之升高.灭菌效果最好、最彻底的灭菌方法[温度和时间]1.05kg/cm2（103.43kPa）的蒸气压力→温度达121.3℃，维持15～30min后，可杀灭一切细菌芽胞和微生物。[应用范围]

凡是耐高温又不怕潮湿的物品，如敷料、手术衣、生理盐水和一般培养基，均可用此法灭菌。61.1～62.8℃经30min，或71.7℃经15～30s（后一种方法多用）。巴氏消毒法[温度和时间]

是用较低温度杀灭液体中无芽胞的病原菌，但不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。常用于不耐高温的物品消毒，如牛奶、酒类等。[应用范围]辐射杀菌法日晒和紫外线[原理]

日光中杀菌的成分主要是紫外线。紫外线的波长在200～300nm时，具有杀菌作用，其中以265～266nm杀菌力最强，易被DNA吸收。细菌DNA吸收紫外线后，其生物学活性发生改变，同时蛋白质也光解变性，导致细菌死亡。

[特点]

紫外线穿透力弱，玻璃、尘埃、纸张、水蒸气均能阻挡紫外线。[应用范围]

日晒是有效的杀菌方法，用于病人的衣服、被褥、书报等的灭菌。紫外线仅适用于手术室、婴儿室、烧伤病房、传染病房和无菌室的空气消毒，亦可用于不耐热物品的表面消毒。电磁辐射和微波原理：电离射线具有较高的能量和穿透力，对微生物有致死作用。包括高速电子、X射线和γ射线等机制：细胞分子产生诱发辐射，干扰DNA合成；破坏细胞膜，损伤酶系统；水分子电离后产生游离基和新分子如过氧化氢等杀菌。用途：电离辐射主要用于不耐热的塑料、橡胶制品、药品和食品的消毒与灭菌。微波：可穿透玻璃、陶瓷、薄塑料，不能穿过金属表面。以热效应杀菌。用途：食品、药杯等消毒滤过除菌法[应用范围]

滤菌器仅可除去细菌，不能除去病毒、支原体、衣原体等微生物。主要用于不耐高温的血清、抗生素、药液等物质。现代医院的手术室、烧伤病房以及无菌制剂室，已逐步采用高效滤菌器。二、化学消毒灭菌法（一）杀菌机制1.菌体蛋白质变性或凝固，例如酚类（高浓度）、醇类、重金属盐类（高浓度）、酸碱类、醛类。2.干扰细菌的酶系统和代谢，例如某些氧化剂、重金属盐类（低浓度）与细菌的-SH基结合使有关酶失去活性。3.损伤菌细胞膜，例如酚类（低浓度），表面活性剂、脂溶剂等，能降低细菌细胞的表面张力并增加其通透性，胞外液体内渗，致使细菌破裂。化学消毒剂按杀菌能力分为3大类。1.高效消毒剂——可杀死所有微生物

（1）含氯消毒剂

次氯酸钠

常用种类二氯异氰酸尿酸钠漂白粉作用机理：这类制剂遇水可产生氯（Cl2）、次氯酸（HClO）及新生态氧。氯可氧化细菌的-SH、次氯酸（HClO）可与胞质成分作用，形成氮-氯复合物，干扰细胞代谢。特点：（1）具有强大的杀菌作用。（2）杀菌谱广，作用快。（3）对金属制品有腐蚀作用。用途：物品表面、饮用水、皮肤、地面、排泄物和污水等的消毒。

（二）分类（2）过氧化物消毒剂常用种类：过氧化氢、过氧乙酸、二氧化氯。

作用机理：主要靠其强大的氧化能力来灭菌。可使细菌酶蛋白中的-SH变为-S-S-，导致其酶活性的丧失。特点：①杀菌能力强。②其中过氧乙酸为强氧化剂，易溶于水，杀菌谱广，无残留毒性，但稳定性差，并有刺激性和腐蚀性，不适合金属器具消毒。③二氧化氯在水中溶解饱和后，即可以气态向空中逸散，空气中浓度达4mg/m3即可杀死99.99%的细菌、病毒、真菌，是当前新型的安全无毒、广谱高效空气消毒净化剂！用途：①3%~6%H2O2可杀死大多数细菌，10%~25%H2O2可杀死所有微生物（包括细菌的繁殖体和芽胞）。H2O2熏蒸可用于空气消毒。H2O2蒸气的等离子无菌技术可替代环氧乙烷对医疗器械灭菌。②过氧乙酸用于物品表面和皮肤消毒。（3）醛类消毒剂常用种类：戊二醛、甲醛。作用机理：对细菌蛋白质和核酸的烷化作用。特点：①具有广谱、高效、快速的杀菌作用。②2%碱性戊二醛对橡胶、塑料、金属器械等无腐蚀作用。③对皮肤黏膜有刺激性。用途：①适用于精密仪器、内窥镜的消毒。②甲醛对人有潜在的毒性作用，使用有限。主要用于HEPA滤器的消毒。（4）环氧乙烷作用机理：对细菌蛋白质和核酸的烷化作用。特点：①为杂环类化合物，沸点10.8℃，易蒸发。气体消毒剂。②有穿透力，杀菌广谱高效，杀灭芽胞能力强。③对多数物品无损害作用。④易燃，对人有一定毒性。空气中浓度不得超过1ppm。用途：现已有特制的环氧乙烷灭菌箱。使用安全方便。2.中效消毒剂—能杀灭微生物的繁殖体，结核分枝杆菌、某些真菌和有包膜的病毒，不能杀死芽胞（1）含碘消毒剂常用种类：碘酊（碘的乙醇溶液）、碘伏（碘与载体的结合物）。作用机理：主要依靠其沉淀蛋白和强大的氧化能力。特点：①可杀死细菌的繁殖体，不能杀死芽胞。②对皮肤有一定的刺激性，消毒后用75%酒精擦净。用途：多用于皮肤黏膜、体温计及其他物品表面的消毒。（2）醇类消毒剂常用种类：乙醇、异丙醇。作用机理：去除细菌包膜中的脂类，使菌体蛋白变性。特点：①70%～75%乙醇杀菌能力最强。②异丙醇的杀菌作用比乙醇强，且挥发性低。但毒性较高。用途：多用于医疗器材、皮肤的消毒、浸泡体温计。3.低效消毒剂—可杀灭多数细菌繁殖体，但不能杀死芽胞、结核分枝杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒（1）季铵盐类消毒剂常用种类：溴铵（商品名为新洁尔灭）作用机理：为阳离子表面活性剂，可吸附细菌的表面，改变胞壁通透性，使菌体内的酶、辅酶、代谢中间产物逸出，呈现杀菌作用。特点：①无色无味、刺激性轻微。②易溶于水，可减低液体表面张力，使物品表面油脂乳化，易于除去，具有清洁作用。③因细菌带阴电荷，故阳离子表面活性剂杀菌作用较强，但不得和阴离子表面活性剂合用。用途：可用于皮肤黏膜、物品表面、地面的消毒。2.氯己定常用种类：商品名为洗必泰。特点：（1）为双胍类化合物，无色无臭，刺激性轻微。（2）不得和阴离子表面活性剂合用。用途：可用于皮肤黏膜、物品表面、地面的消毒。3.高锰酸钾特点：具有氧化杀菌作用。用途：可用于皮肤黏膜冲洗、浸泡消毒及食（饮）具、蔬菜、水果的消毒。第三节消毒灭菌的运用一、医疗器械物品的消毒灭菌（一）高危器械物品进入无菌组织的物品高压蒸气灭菌耐受热力灭菌的物品高效消毒剂（环氧乙烷、戊二醛）耐受热力灭菌的物品（二）中危器械物品不进入无菌组织，但须接触黏膜的物品流通蒸汽、煮沸、高压蒸气灭菌过氧乙酸、醇类、戊二醛浸泡浸泡前必须彻底洗净，防超敏反应。（三）低危器械物品只接触未损伤的皮肤，不进入无菌组织，不接触黏膜（四）快速周转的医疗器械消毒灭菌时间短又不损伤器材，难度较大纤维内窥镜、牙钻、牙科手术器械常用瞬时灭菌、微波灭菌、高效消毒剂中效消毒剂/低效消毒剂+低热（60℃）协同法二、室内空气消毒法（一）物理消毒法1.紫外线1.5w/m31h

最常用2.滤过除菌孔径＜0.2μm（二）化学消毒法1.过氧乙酸喷雾0.5%水溶液30ml/m32.熏蒸3.二氧化氯溶液4mg/m34.中草药三、手和皮肤的消毒（一）肥皂和流动水经常正确洗手是预防多种病原微生物感染的有效方法。（二）被病原微生物污染时

1.75%酒精

2.氯己定溶液

3.过氧乙酸

4.次氯酸钠溶液

5.碘伏四、黏膜的消毒（一）口腔黏膜3%H2O2（二）冲洗尿道、阴道、膀胱0.1%~0.5%氯己定溶液；1g/L高锰酸钾溶液五、病人排泄物与分泌物的消毒灭菌（一）多用含50g/L次氯酸钠、漂白粉1h（二）等量200g/L漂白粉搅拌均匀2h六、病人污染物品的消毒（一）日常生活小用具1.煮沸15~30min/流通蒸汽30min；2.0.5%过氧乙酸浸泡、擦洗、喷洒。（二）污染的食品、果品禁止再食用，用200g/L漂白粉乳剂处理2h；煮沸30min；焚烧。（三）衣服、被褥用流通蒸汽消毒30min；含5%有效氯的消毒液30min

；15%过氧乙酸1g/m3熏蒸1h。（四）运输工具用5%过氧乙酸擦洗、喷洒地面；2%过氧乙酸8ml/m3熏蒸1h。七、饮水的消毒（一）自来水用氯气消毒（二）少量的饮用水可用漂白粉消毒八、环境的消毒（一）房间、地面、墙壁、门窗可用过氧乙酸或含氯消毒液（二）厕所、阴沟可用生石灰（三）垃圾可用焚烧/有效氯的消毒液喷洒（四）污水可用有效氯的消毒液喷洒一、微生物的种类（一）微生物对消毒灭菌敏感性高低的排序真菌、细菌繁殖体、有包膜病毒、无包膜病毒、分枝杆菌、细菌芽胞。（二）不同种或同种不同株间微生物内在的抗性相差也很大从一种微生物得到的灭活数据不能推导到另一种微生物。一种可杀灭细菌的消毒剂，不一定能灭活病毒。灭活朊粒需要的能量是正常热力灭菌的6倍！肝炎病毒（尤其乙肝病毒）比其他病毒和大多数细菌繁殖体对热和消毒剂的抗性强。二、微生物的物理状态微生物的生长情况显著影响它们的抵抗力。第四节影响消毒灭菌效果的因素三、微生物的数量微生物最初的数量越大，所需消毒的时间越长。四、消毒剂的性质、浓度与作用时间（一）消毒剂的性质消毒剂的理化性质不同对微生物的作用大小各异。例：表面活性剂对G+菌杀灭效果比对G-菌效果好；表面活性剂一般只能对细菌繁殖体有作用，不能杀灭细菌的芽胞和真菌；氧化剂中的过氧乙酸和含氯化合物对环境和空气中的病毒作用效果好。（二）消毒剂的浓度同种消毒剂的浓度不同，其消毒效果也不同。绝大多数消毒剂在高浓度时杀菌作用强大，降低到一定浓度时，只有抑菌作用。乙醇或异丙醇例外。（三）作用时间消毒剂在一定浓度下，对细菌作用时间越长消毒效果也越好。（四）温度消毒剂的杀菌实质上是化学反应。其反应速度随温度升高而加快。故温度升高可提高杀菌效果。例：2%戊二醛杀灭104/ml炭疽芽胞时20℃需15min40℃需2min56℃仅需1min。六、酸碱度

消毒剂的杀菌作用受pH影响。例如：戊二醛本身呈酸性，其水溶液呈弱酸性，不能杀死芽胞。只有加入NaHCO3后才能起作用。苯扎溴铵的杀菌作用是pH越低，杀菌所需药物浓度越高。pH3时所需的杀菌浓度较pH9时要高10倍。七、有机物环境中有机物存在，能够显著影响消毒剂的效果。有机物可阻碍消毒剂与病原菌接触并消耗药品。第五节病原微生物实验室生物安全一、病原微生物的分类根据病原微生物的传染性、感染后对个体或群体的危害程度分为4类：（一）第一类是能够引起人类或动物严重疾病、我国尚未发现或已经宣布消灭的微生物（共29种）如：天花病毒、克里米亚-刚果出血热（新疆出血热）、埃博拉病毒、猴痘病毒、亨德拉病毒等。（二）第二类是能够引起人类或动物严重疾病，比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物（70种）1.人间传染的有：汉坦病毒、高致病性禽流感病毒、爱滋病毒（Ⅰ型和Ⅱ型）、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒（街毒）、SRAS冠状病毒（Ⅰ型和Ⅱ型）、西尼罗病毒、炭疽芽胞杆菌、布鲁菌属、结核分枝杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌等。（三）第三类是指能引起人或动物疾病，但在一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传染风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物（共275种）

人间传染的有腺病毒、肠道病毒、鼻病毒、登革病毒、轮状病毒、各型肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、流行性感冒病毒、百日咳鲍特菌、伯氏疏螺旋体、胎儿弯曲菌、沙眼衣原体、破伤风梭菌、致病性大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒沙门菌、志贺菌属、表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌等。（四）第四类是指在通常情况下不会引起人类或动物疾病的微生物如小鼠白血病病毒。其中第一类和第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物

二、病原微生物实验室的分级根据实验室对病原微生物的生物安全防护水平（biosafetylevel，BSL）及实验室安全国家标准，实验室分为四级。病原微生物实验室分级级别处理对象一级对人体、动植物或环境危害较低，不具有对健康成人、动植物致病的致病因子二级

对人体、动植物或环境具有中等危害或具有潜在危险的致病因子，对健康成人、动植物和环境不会造成严重危害，有有效的