光合细菌Rhodoseudomonasacidohila的胞外聚合物的提取

光合细菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物的提取研究摘要：采用了五种不同的方法——EDTA、NaOH、H2SO4、热提取和高速离心，对光合细菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物（EPS）进行提取。结果表明，EDTA法是一种比较好的提取方法，提取效率高，对细胞破坏小。EPS中的多糖、蛋白和核酸含量分别为6.5、58.4、5.4mg/g干重。EDTA的适宜提取时间1～3h，用量约为2.8g/g干重。采用不同的提取方法，提取的EPS中的组分含量大不相同。本文还采用了两种方法检查细胞的破坏程度，一种是测定核酸含量，一种是测定光合细菌提取前后UV-Vis光谱和EPS的UV-Vis光谱，两种方法的结果一致。EDTA提取方法中，细菌的UV－Vis峰强度在提取前后没有变化，EPS溶液中也没有新的色素峰出现，说明基本没有细胞被破坏。由于UV－Vis光谱测定方便快速，可以用来监测在EPS提取过程中细胞的溶解情况。关键词：胞外聚合物；光合细菌；UV-Vis光谱；蛋白；核酸；多糖；提取ExtractionoftheextracellularpolymericsubstancesfromaphotosyntheticbacteriumRhodopseudomonasacidophilaAbstract:Amongthefivemethodsforextractingextracellularpolymericsubstances(EPS)fromRhodopseudomonasacidophilausingEDTA,NaOH,H2SO4,heatingandhighspeedcentrifugation,EDTAextractionwasfoundtobethemosteffectivemethodbecauseofhigherextractionefficiencyandlowercelllysis.ThecontentsofthemajorcomponentsofEPSfromR.acidophila,i.e.,carbohydrate,proteinandnucleicacid,were6.5,58.4and5.4mg/gdrycell,respectively.Thefeasibleextractiontimewas1-3handtheEDTAdosagewasabout2.8g/gdrycellsforEDTAextraction.Twomethods,i.e.thecontentofnucleicacidandUV-Visspectrum,wereusedtoevaluatecelllysisduringextraction.TheabsorptionpeaksforphotosyntheticpigmentsinUV-VisspectrumseemednochangepriortoandafterEDTAextraction,andnopigmentpeaksappearedinthespectrumofEPS,indicatingthatfewcellsweredestroyedandthatlysisdidnotoccurduringEDTAextraction.TheUV-VisspectrumcouldbeusedtomonitorthecelllysisduringEPSextractionfromRacidophila.Keywords:Carbohydrate;Extracellularpolymericsubstances;Extraction;Nucleicacid;Rhodopseudomonasacidophila;UV-Visspectrum;Protein微生物利用有机废水产氢已经引起了人们广泛的兴趣，其中光合细菌（PSB）被认为是最有应用前景的一种产氢微生物，文献中报道一些光合细菌，例如Rhodobactersp.[1]，能够利用低级有机酸作为电子受体，光作为能源，产生氢气。从应用观点看，光合细菌要能够在光反应器中生长和连续产氢，反应器中微生物必须保持一定的浓度，但是，由于光合细菌的絮凝沉降性能不好[2]，不能有效的和溶液分离，在产氢光反应器中，光合细菌一般浓度都很低。为了解决这个问题，必须研究PSB的絮凝沉降特性。细菌的絮凝性能和胞外聚合物（EPS）有很大的关系。EPS是吸附在细菌表面的一些高分子聚合物（Mw>10000），主要来源是微生物分泌、细胞产物自溶和废水中的有机物的吸附[3]。EPS的主要成分是多糖、蛋白和核酸，它们的含量对细菌的絮凝性能有着显著的影响。EPS的研究最早应用于好氧活性污泥中，到目前为止，对水处理中好氧活性污泥和厌氧污泥、颗粒污泥、生物膜等已经进行了大量的研究[4－6]，但是对光合细菌的EPS特性研究很少。Watanabe等人[2]分离了一株海洋光合细菌，Rhodovulumsp.，并且研究了它的絮凝特性，他们认为胞外核酸的含量是影响光合细菌絮凝性能的最主要因素，但该株细菌能不能产氢没有报道。本文选用了一株产氢光合细菌Rhodopseudomonsaacidophila，比较了几种常用的不同的EPS提取方法的提取效率。基于比较结果，选择EDTA作为提取方法，进一步研究提取时间和提取剂用量的对EPS提取的影响。而且，对EPS的UV-Vis和红外光谱特性也进行的简单的研究，并且提出了一个简单方便的方法，用来判断提取过程中的细胞破坏程度。1．材料与方法1.1光合细菌R.acidophila,从中国水产科学研究院东海水产研究所购得。这株光合细菌能够利用乙酸、丙酸、丁酸产氢。在4000Lux，30oC下，当底物为1.8g/l乙酸、1.0g/l丙酸、0.4g/l丁酸的混和酸时，在208小时以内，该PSB能够产生494ml氢气，最大产氢速率为21.9ml/l/h。生长培养基成分为(每升)：KH2PO40.5g,K2HPO40.6g,NaCl0.4g,MgSO4·7H2O0.2g,CaCl2·2H2O0.05g,(NH4)2SO41.25g,琥珀酸钠9.8g，1ml微量元素溶液。培养基的pH为7.0，培养温度32oC，光照强度3000Lux，充氩气保持厌氧环境。1.2EPS的提取方法采用五种方法从R.acidophila提取EPS，即EDTA、NaOH、H2SO4、热处理和高速离心。分别取40mlPSB培养液，12000rpm，4oC离心10min，菌体用0.9%NaCl溶液洗涤两次，然后重悬于10ml二蒸水中，再分别加入一定量的EDTA(2%)、NaOH(1N)、H2SO4(8%)溶液，4oC放置提取3h。为了比较，另取两份，分别采用热提取(70oC，1h)和高速离心方法提取EPS。然后，将细菌EPS溶液经4oC12000rpm离心15min，除去剩余的细菌，上清液为EPS溶液。因EDTA干扰蛋白的测定，将EDTA提取的EPS溶液对二蒸水透析过夜。最后，将所得的EPS溶液经0.45µm醋酸纤维素膜过滤，再进行成分分析。1.3分析方法多糖用蒽酮法测定，蛋白用Lowry法测定，核酸含量用紫外吸收法测定。Ca2+和Mg2+用原子吸收法测定(WFx-120，Rayleigh分析仪器公司)。为了测定EPS的红外光谱，将两倍预冷乙醇加入EPS溶液中，沉淀重悬于双蒸水中，透析过夜，再用乙醇沉淀，沉淀物用乙醇洗涤两次，最后真空干燥。干燥的沉淀物用于IR分析(VECTOR22,Bruker公司)。UV－Vis光谱用岛津UV-2401PC仪器分析。2.结果与讨论：2.1提取方法的比较不同提取方法的比较结果列于表1。结果表明，提取出的EPS量和提取方法有很大关系，其中，NaOH法，提取的EPS最多，热处理和EDTA法次之，H2SO4法和高速离心最少。一个好的提取方法，不但提取效率要高，而且对细胞的破坏要少，一般核酸的含量用来评价提取过程中细胞破坏程度[7]。上述五种提取方法中，提取的EPS溶液中核酸含量大小顺序为：NaOH>热提取>EDTA>H2SO4>离心。用NaOH提取EPS，核酸的含量是用离心法的9.6倍，说明提取过程中细胞破坏严重，大量提取出来的EPS其实是胞内物质。同样，热提取的EPS中，核酸含量也很高。EDTA法、硫酸法和离心法对细胞破坏少，但是硫酸法和离心法提取的EPS量很少，提取效率低，不是一种有效的提取方法。结果表明，EDTA的提取效率高，对细胞的破坏少，是一种从R.acidophila中提取EPS的有效方法，比其他几种方法要优越。用EDTA提取的EPS中多糖，蛋白、核酸的含量分别为6.5,58.4和5.4mg/g干重。在以后的实验中，都采用EDTA法来提取EPS。从表中还可以看出，用不同的提取方法，提取的EPS量在12.9~159.2mg/g干重中变动，同样多糖蛋白比值在0.06~1.71范围内。由上述讨论可知，EPS的提取方法和操作步骤同时影响提取的EPS的成分和含量。表1.不同方法从R.acidophila中提取的EPS的含量(mg/g干重)与多糖/蛋白比EDTANaOHH2SO4热提取高速离心多糖6.57.710.610.34.1蛋白58.4126.66.237.76.2核酸5.424.94.623.62.6总EPS70.3159.221.471.612.9多糖/蛋白0.110.061.710.270.66从R.acidophila中提取的EPS中，蛋白的含量和Watanabe等人[2]从海水中分离的Rhodovulumsp.的EPS中蛋白含量基本相同，但是多糖和核酸的含量却小于Rhodovulumsp.的EPS中的，Rhodovulumsp.的EPS中多糖/蛋白约为0.6，远远大于R.acidophilaEPS中的多糖/蛋白0.11。由于Rhodovulumsp.具有良好的絮凝性能，而R.acidophila絮凝性能相对较差，EPS的含量和物质成分的差别可能也是一部分原因，Watanabe等认为胞外核酸在细菌的絮凝性能中起主导作用。2.2提取时间和提取剂用量的影响从图1和2可以看出，EPS中蛋白含量受提取时间和提取剂用量影响很大，而多糖和核酸几乎不受影响。当提取时间超过1h，EPS的含量基本保持不变，维持在48.4，7.5和7.3mg/g干重左右。EDTA的提取速度快，可能是由于EDTA和二价离子的络合反应速度很快。从图2(A)中可以得出，当EDTA的用量从0.8增加到2.8g/g干重时，EPS的量也从29.9迅速增加到84.3mg/g干重，然而当EDTA用量继续增加时，提取的EPS的量基本保持不变。这和细菌培养液中多价离子含量有限有关，当多价离子都被EDTA络合后，再增加EDTA的量，将不会显著的提高EPS的提取效率。从图2(B)中可以看出，Ca2+和Mg2+的含量随着EDTA的用量增加而增加，到2.8g/g干重之后，这些二价离子的浓度都基本上保持不变或略有降低。这些二价离子的浓度和蛋白的浓度有一定的相关性，EPS中Ca2+和Mg2+的含量增高，蛋白的含量也增大，说明在细菌EPS中，这些二价离子是主要和蛋白结合的，因为在中性条件下，蛋白质的羧基会离解而带负电，然后就靠这些二价离子通过离子桥接把EPS和细菌结合在一起。当EDTA除去这些离子时，EPS也就随之释放到溶液中去了。图1.提取时间对EPSS量的影响图2.提取剂用量的影响响：(A)EPS量；(B)Caa2+和Mg2+含量EPS中三种主要物质的提取难易程度也有所不同，从图2可以看出，用EDTA提取，多糖和核酸比较容易提取，在少量的EDTA存在下，较短的时间就能提取比较完全，而蛋白比较难提取，很大的EDTA剂量才能提取比较完全。这说明，提取的操作也同时影响着提取的EPS的量和成分。2.3EPS红外光谱图3是从R.acidophila中提取的EPS的红外光谱图。谱图中有五个很明显的峰：3422，2923，1635，1395，1055cm-1，其中3422处峰是OH伸展振动产生的，2923处的较弱的峰是C－H振动峰，而1635和1395处是羧基中C=O不对称和对称伸展振动峰。处于1000~1200处的吸收峰一般为糖衍生物的典型吸收峰。从红外光谱谱图中，我们可以知道，EPS中含有的最主要的活性基团是羧基和羟基。2.4UV－Vis光谱图3.R.accidophhila的EPS的红外光谱谱图4.A：EPSS提取前后R.aciddophilla溶液UV-Viis光谱；B：EDTA和NaOH提取的EPSUUV－Vis光谱图4(A)为PSB提取前和经EDTA和NaOH提取后的UV-Vis光谱图，图4(B)为从PSB中提取的EPS的Uv-Vis谱图。从图4(A)可以看到细胞色素的几个典型吸收峰，590，800，860nm，如果在提取过程中细胞被破坏，胞内物质泄漏出来，则提取前后细胞的吸收峰强度在谱图上就应该可以看出发生了改变，而且在EPS谱图上应该也可以观察到类似的吸收峰，因而，可以利用UV－Vis谱图来判断提取过程对细胞的破坏程度。从图上可以看出，EDTA提取前后细胞色素峰的强度几乎没有改变，EDTA提取的EPS的UV-Vis谱图上也没有色素峰的出现；而经过NaOH提取，细胞悬浮液的峰强度明显减弱，甚至消失，而在NaOH提取的EPS谱图上，液可以看到有色素峰的出现。这个现象说明，EDTA提取方法对细胞破坏少，而NaOH方法细胞破坏却很严重，这个结果也和前述核酸数据相符。细胞破坏程度是判断一种提取方法是否恰当的一个重要指标，很难估计，缺少一个标准判断方法。以前一般用蛋白或者核酸的含量来判断，但是EPS本身中也含有大量的蛋白和核酸，所有这种方法并不是很恰当，后来有用ATP或葡萄糖－6－磷酸脱氢酶这些胞内物质的含量来判断[7]，可是这些物质的测量方法都很费时费事，使用中受限。UV－Vis作为一种快速方便的方法，可以用来评价EPS提取过程中的细胞破坏程度。3.结论：从R.acidophilaEPS的提取方法比较来看，EDTA法的提取效率高，对细胞的破坏程度小，是一种较好的提取EPS的方法。用EDTA法提取的EPS量为70.3mg/g干重。EDTA的适宜提取时间约为1～3h，提取剂量约为2.8gEDTA/g干重。提取方法，提取时间和提取剂的用量都会影响提取的EPS的量和成分。同样，从EPS和细菌的UV－Vis数据中同样可以看出，EDTA对细胞的破坏较小，而NaOH破坏很大。提取过程中细胞的破坏程度是判断一种提取方法优劣的一个重要指标，但目前缺少一个标准判断方法，UV－Vis法作用一种方便快速的方法，有可能用来判断EPS提取过程中细胞的破坏程度。参考文献[1]ErogluI,AslanK,GunduzU,YucelM,TurkerL.SubstrateconsumptionratesforhydrogenproductionbyRhodobactersphaeroidesinacolumnphotobioreactor.JBiotechnol,1999,70:103-113[2]WatanabeM,SasakiK,NakashimadaY,KakizonoT,NoparatnarapornN,NishioN.GrowthandflocculationofamarinephotosyntheticbacteriumRhodovulumsp.ApplMicrobiolBiotechnol,1998,50:682-691[3]MorganJW,ForsterCF,EvisonL.Acomparativestudyofthenatureofbiopolymersextractedfromanaero