WesternBlotting的原理方法及常见问题分析汇编

WesternBlotting的原理方法及常见问题分析WesternBlotting的原理试验前应准备的试剂及材料WesternBlotting试验步骤影响Westernblotting成功的要素常见问题分析与对策南方医科高校中医药学院分子生物学试验室一、概述通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达状况的信息。WesternBlotting的原理

组织或细胞样品蛋白的提取试剂蛋白定量试剂

丙烯酰胺凝胶配置试剂转膜缓冲液试剂固相载体（PVDF\NC\尼龙膜）封闭液、洗脱液、抗体稀释液一抗、二抗化学显影液

二、试验前准备的试剂及材料

2.7

一抗二抗的选择

2.7.1一抗的选择

2.7.2二抗的选择

二、试验前准备的试剂及材料

3.1组织或细胞样品蛋白的提取a蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白线粒体蛋白等。b样品来源分类：单层贴壁细胞、悬浮细胞少量或微量组织样品大量组织样品难裂解组织样品一般组织样品

三、WesternBlotting试验步骤

3.2蛋白定量考马斯亮兰法BCA法Lowry法BCA蛋白定量法操作：

三、WesternBlotting试验步骤孔号012345678蛋白标准溶液（μL）0124812162020去离子水（μL）20191816128400对应蛋白含量（μg）00.51.02.04.06.08.010.？A+B（50：1）200200200200200200200200200振荡30s，37℃30分钟，A562nm测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；计算出蛋白含量。

3.3凝胶浓度的选择及配置蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008三、WesternBlotting试验步骤3.4蛋白Marker的作用

预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪，有利找准自己的目的蛋白。

12%10%8%5%总体积10ml10ml10ml2ml超纯水3.344.61.430%丙烯酰胺43.32.70.331.5MTirs2.52.52.50.2510%APS0.10.10.10.0210%SDS0.10.10.10.02TEMED0.0040.0040.0060.0036

3.6蛋白样品变性（时间、温度）3.6蛋白样品上样（依次、体积）3.7电泳

三、WesternBlotting试验步骤？三、WesternBlotting试验步骤3.8切胶、泡胶、叠胶

滤纸2张滤纸1张PVDF膜1张滤纸3张凝胶1块阳极Ⅰ阳极Ⅱ阴极胶、滤纸、膜浸泡位置3.9转膜时滤纸、胶、膜的叠加依次

三、WesternBlotting试验步骤半干转膜的条件：

分子量大小

电流=Sx3叠加示意图正极负极3.10封闭

3.11洗脱3.12加一抗（抗体名称、来源、浓度、时间）孵育

三、WesternBlotting试验步骤

3.13洗脱3.14加二抗（抗体名称、来源、浓度、时间）3.15孵育、洗脱3.16加ECL发光液三、WesternBlotting试验步骤3.17结果的检测及分析三、WesternBlotting试验步骤结果分析例图1比较均一的高背景斑点、发泡式或闪烁式的高背景信号弱或者无信号非特异性条带弥散型条带白色条带、黑点或信号下降太快常见问题分析三、常见问题分析高背景原因：解决办法抗体浓度太高优化/降低一抗和二抗浓度抗体孵育温度过高4℃孵育封闭液不适合比较尝试不同的封闭液封闭不完全封闭液的选择与优化增加封闭液中蛋白质浓度优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4°过夜）抗体与其它蛋白质交叉反应更换不同的封闭液；降低二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性

高背景原因：解决办法漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积漂洗液中加入Tween-20；浓度0.05％曝光时间太长缩短曝光时间膜的问题使用干净镊子；戴手套操作换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜膜干燥保证充分的反应液，避免出现干膜现象缓冲液污染使用新缓冲液过滤缓冲液高背景如图所示:

信号弱或者无信号原因：解决办法转膜不完全1.转膜后，染胶以决定转膜效率2.保证转膜时胶与膜充分结合(赶气泡）3.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配4.电转时防止过热（加冰）5.使用阳性对照或预染Marker6.优化转移时间和电流7.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇）蛋白质与膜结合不充分1.小蛋白转印增加电转移缓冲液中甲醇的浓度至20%；2.大蛋白转印降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%3.低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜（0.22u）一抗、二抗等不匹配一抗与组织种属相匹配，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配。抗体增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性抗原不足增加上样量

信号弱或者无信号抗原被封闭液遮蔽试用不同的封闭液优化封闭液中蛋白质浓度缩短封闭时间缓冲液里有叠氮钠去掉叠氮钠底物孵育时间太短不少于2分钟底物丧失活性ECL发光液的选择及发光也的有效期底物与二抗孵育发光检测保证两种底物成分没有交叉污染膜被剥离过剥离会导致抗原丢失或变性避免重复检测膜上蛋白质被消化（gelatin)封闭物质可能有蛋白质降解活性蛋白质在储存过程中降解重新制备样品信号弱或者无信号如图所示：多非特异性条带或条带位置不对蛋白表达模式的分化使用原始或传代少的细胞株，或平行实验体内表达的蛋白具有多种修饰形式查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小蛋白样本降解新鲜制备，并使用蛋白酶抑制剂一抗浓度过高降低抗体浓度，可以减少非特异性条带二抗浓度过高产生非特异性结合降低抗体浓度，选择特异性更强二抗抗体未纯化单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带蛋白存在二聚体或多聚体电泳上样前，煮沸10min，增强蛋白质解聚变性？多非特异性条带或条带位置不对如图所示:弥散型条带原因：解决办法：抗体浓度太高降低抗体浓度电泳时电压过大降低电泳时电压（100v）蛋白质上样量太多降低蛋白质上样量其他常