sp09第九章食品卫生微生物学检验-本科必修课-食品微生物

第九章食品卫生微生物学检验食品卫生的目的就是：控制有害因素、保证食品安全和促进人体健康。

我国制定的食品卫生标准包括三个方面内容：感官指标、理化指标和微生物指标。本章讲述食品卫生的微生物学检验的总则及其方法。第一节食品卫生微生物学检验的总则食品卫生的微生物学检验：是应用微生物学的理论和方法，根据卫生学的观点，来研究食品中的微生物的有无、种类、性质、活动规律以及对人类生产和健康的影响。步骤：采样、处理、检验、报告等几个步骤。一、食品检样的采集与送检1.样品采集直接食用的小包装食品大批的或不包装的食品大容器包装的液体食品大块冷冻食品在流水线上采样食品表面擦拭采样

2.采样记录采样应使用专用的记录表格。内容：样品名称、生产者、生产日期，该批食品的批号和数量，存放地点，采样时的气温情况、样品数量、必要的说明。采样人签名。3.样品的运送①根据需要进行保存。冷冻样品应保存在-20℃，冷藏样品应保存在0~4℃，冷藏时间不超过36小时。如果食品是干燥的或罐头则不需冷藏。②样品包装应防止破溃、溢出或温度改变。③样品容器上应贴以防水性标签，写明最基本的内容。④最好由专人送到实验室。4.注意事项最重要的是：采样要具有代表性；采样必须在无菌操作下进行是非常关键的。二、送检样品的处理1.对微生物实验室的要求微生物实验室不受外界因素的干扰，能够独立地进行工作并对检测结果负责。实验室应有与检测业务相适应的技术人员和技术水平、仪器设备。2.样品的接收

①样品数量的多少，其包装是否完好，样品温度是否变化。②干燥的样品有无受潮现象，冷冻样品是否融化，易腐样品有无腐败变质现象。③样品接收人签字。3、样品的处理①固体样品：

用灭菌刀、剪或镊子称取不同部位样品10g，剪碎，放入灭菌容器内，加定量水（如不易剪碎者，可加海沙研磨）混匀，制成1：10混悬液，进行检验。在处理蛋制品时，加入约30个玻璃球，以便振荡均匀。生肉及内脏，先进行表面消毒，再剪去表面样品，采取深层样品。②液体样品

原包装样品：用点燃的酒精棉球消毒瓶口，再用经石炭酸或来苏尔消毒液消毒过的纱布将瓶口盖上，再用经火焰消毒的开罐器开启。摇匀后，用无菌吸管直接吸取。

含有二氧化碳的液体样品：可按上述方法开启瓶盖后，将样品倒入无菌磨口瓶中，盖上一块消毒纱布。将盖开一缝，轻轻摇动，使气体逸出后进行检验。

冷冻样品：冷冻的样品应于检验前解冻，一般可在0~4℃解冻，时间不超过18hr，也可在45℃下解冻，时间不超过15min。③罐头：

密闭试验：将被检罐头置于85℃以上的水浴中，使罐头沉入水面以下5cm，然后观察5min，发现小气泡连续上升者，表明漏气。膨胀试验：将罐头在37±2℃环境下7天，观察罐头盖和底有无膨胀现象。先用酒精棉球擦去罐上油污，然后用点燃的酒精棉球消毒开口的一端。用来苏尔消毒液纱布盖上，再用灭菌的开罐器打开罐头，除去表层，用灭菌匙或吸管取出中间部分的样品，进行检验。三、检验选择适当的检验项目和方法。检验完毕，应及时填写报告单，经签名、核实后加盖公章以示生效。一般阳性样品在报告发出后3天才能处理，进口食品6个月。阴性样品可及时处理。(一)细菌总数的测定1.固体样品：2.液体样品：(二)大肠菌群最近似数（MPN）：1.发酵试验2.分离培养3.复发酵试验MPN：themostprobablenumber(三)大肠杆菌最近似数（MPN）测定：1.发酵试验

2.分离培养和接种蛋白胨水3.证实实验

(四)常见致病菌检验

有关常见致病菌的检验方法，已汇编于中国预防医学科学院标准处编写的《食品卫生国家标准汇编（1）、（2）》一书中。如有需要，请查阅此书。

第二节显微镜检验一、不染色标本检查未经染色的标本为不染色标本。检查不染色标本，是为了观察微生物细胞在生活时期原有的形状、大小和确定细胞能否运动等。基本的制片方法有压滴法和悬滴法。在进行不染色标本检验时，一般用普通光学显微镜直接观察，但如用相差显微镜或暗视野显微镜效果更好。二、染色标本检查

染色标本，可以显示细胞成分的性质及其分布的位置，区别活菌或死菌，鉴别微生物的种类等。第三节培养检查一、培养基种类常用的培养基有以下四类：基础培养基选择性培养基鉴别培养基特殊培养基二、微生物的接种与培养

（1）接种：常用的接种方法有涂布法、划线法、倾注法、点种法、穿刺法和浸洗法等。（2）微生物的培养①需氧培养恒温培养箱中培养②厌氧培养厌氧罐法；加组织的培养基培养法：常用的有肝片肉汤、肝片肝汤、肉渣汤等培养基；焦性没食子酸法；共栖培养法；亨盖特厌氧操作技术③二氧化碳培养法：常用的培养方法有蜡烛缸法、硫酸-碳酸钠法等。三、培养结果观察（1）固体培养基上菌落性状的观察观察菌落特征包括其大小、形状、边缘、隆起度、颜色及透明度等，通常用肉眼观察，再用放大镜观察，必要时可用低倍镜检查。（2）液体培养基内培养性状的观察观察项目包括：浑浊度、沉淀、表面、培养液的颜色以及是否产气等。（3）半固体培养基中培养特性观察第五节生化试验各种微生物均含有各自独特的酶系统，用于进行合成代谢及分解代谢，在代谢过程中产生的分解产物及合成产物也有各自的特点，可借以区别和鉴定微生物的种类。利用这种特点来鉴别微生物的方法称为生化试验或生化反应。一、糖类代谢试验1、糖发酵试验不同的微生物可对各种糖类、醇类、糖苷类等进行分解，但其分解能力和分解产物均因不同的微生物而不同。检查方法：将微生物的纯培养物分别接种于不同的糖、醇液体或半固体培养基中，37℃培养1~14天，每天观察产酸情况并作记录。产酸情况用溴甲酚紫指示剂来鉴别（由蓝紫色变成黄色），产气的情况可由倒置的小管内观察。大肠杆菌有甲酸解氢酶，能分解糖类产生甲酸，并进一步将甲酸分解成二氧化碳和氧气，故产酸又产气，而沙门氏菌无甲酸解氢酶，分解葡萄糖只产酸而不产气。用于观察微生物对某些糖类分解的能力以及不同的分解产物，从而进行微生物学鉴定。2、甲基红（M.R.）试验和V-P试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而使培养基的pH降至4.5以下，因此，加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌在葡萄糖的代谢过程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基内蛋白质中的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即V-P反应阳性。检查方法：将被检菌同时接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基内，于37℃培养2~4天，一支加入甲基红指示剂2滴，立即观察结果，红色为阳性，黄色为阴性。另一支加入V-P试剂，充分振摇，呈现红色为阳性反应。3、β–半乳糖苷酶试验原理：某些能产生β–半乳糖苷酶的微生物，只有在含有乳糖或β–半乳糖苷化合物的培养基生长时，才有该酶的活力。试验时常在培养基中加入乳糖类似物O-硝基苯酚-β–半乳糖苷（ONPG），当培养基由无色转变成深黄色时，说明ONPG被β–半乳糖苷酶分解，产生了深黄色的化合物O-硝基苯酚。检查方法：将细菌接种于三糖铁琼脂或1%乳糖斜面上，于37℃培养18小时，刮取1满环在0.25ml盐水中使成浓菌液。加入甲苯1滴，振摇，于37℃放置5分钟，使酶释出，加入ONPG试剂0.25ml，于37℃放置30分钟，1小时，24小时，观察结果。阳性呈黄色，阴性为无色。二、蛋白质及氨基酸代谢试验1、靛基质（吲哚）试验原理：某些微生物含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生靛基质。当它与对二甲氨基苯甲醛作用时，形成玫瑰靛基质而呈红色。检查方法：将菌种接种于含有丰富的色氨酸胨水中，37℃1~2天后加入柯凡氏试剂0.5ml，阳性者在液面接触处产生玫瑰红色。2、硫化氢试验原理：某些微生物含有脱氨酶，能分解蛋白质中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），脱去氨基生成硫化氢。硫化氢遇到铅盐或铁盐，则发生作用生成黑色的硫化铅或硫化铁。检查方法：将菌种接种于三糖铁或柯氏双糖培养基中，37℃培养18~24小时培养，产生黑色者为阳性。3、尿素酶试验原理：某些微生物能产生尿素酶，分解培养基中的尿素而产生氨，使培养基变成碱性，酚红指示剂变成红色。检查方法：将菌种接种于尿素培养基中，置37℃18~24小时培养，细菌分解尿素后由于产碱使培养基变红为阳性反应。4、苯丙氨酸脱氨试验某些微生物具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸。苯丙酮酸遇到三氯化铁时，即呈现蓝绿色。本试验可用于多种微生物的鉴定。5、氨基酸脱羧酶试验原理：某些微生物含有氨基酸脱羧酶，使氨基酸脱羧，产生胺类和二氧化碳。胺类的形成能使培养基变碱而使指示剂变色。检查方法：从琼脂斜面挑取培养物接种于氨基酸脱羧酶培养基，同时接种一支对照管，用灭菌液体石蜡封闭液面。置37℃培养4天，每天观察结果，与对照管相比显紫色为阳性，与对照管颜色相同为阴性。三、呼吸酶类试验1、硝酸盐还原试验原理：某些微生物如沙门氏菌等能把培养基的硝酸盐还原成亚硝酸盐。在酸性环境下，亚硝酸盐能与对氨基苯磺酸作用，生成对重氮苯磺酸。当对重氮苯磺酸与α–萘胺相遇时，结合成为紫红色的偶氮化合物N-α–萘胺偶氮苯磺酸。检查方法：将被检菌种接种于含有1%硝酸钾蛋白胨水中，37℃1~4天培养，另将试剂甲液（对氨基苯磺酸）和乙液（α–萘胺）在使用时临时等量混合滴加少许于培养物中，立刻或10分钟内呈现红色为阳性。2、氧化酶（细胞色素氧化酶）试验

原理：氧化酶即细胞色素氧化酶，在有分子氧和细胞色素C存在时，能氧化盐酸二甲基对苯二胺，并和α-萘酚结合，生成吲哚酚蓝（靛酚蓝），呈蓝色反应。检查方法：取1%盐酸二甲基对苯二胺溶液和1%α-萘胺酒精溶液各一滴，滴加在20小时培养的琼脂培养物上。阳性者30秒钟内产生蓝色反应，阴性反应观察至2分钟。3、过氧化氢酶试验原理：底物氧化脱下的氢传递给分子氧而形成过氧化氢。需氧菌和兼性厌氧菌都具有这两种终末呼吸酶。厌氧菌不具有这两种终末呼吸酶，它不能使形成的过氧化氢分解。故不能在有氧条件下生长。检查方法：过氧化氢酶：取18~24小时培养的菌落，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢1滴，产生大量气泡为阳性。或者取18~24小时培养物1环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢1~2ml，产生大量气泡者为阳性。过氧化物酶：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等量混合，滴加于菌落上，于2分钟内呈蓝色者为阳性。四、其他生化实验方法有机酸盐及铵盐利用试验毒性酶类试验氰化钾抗性试验第五节血清学检验血清学检验：是根据抗原与抗体在体外发生特异性结合，并在一定条件下出现各种抗原-抗体反应的现象，用于检验抗原或抗体的技术。血清学检验技术广泛用于传染病的诊断、病原微生物的分类鉴定及抗原分析，测定毒素与抗毒素的单位以及生物学、生物化学、遗传学等方面。一、抗原和抗体1、抗原：凡能刺激机体产生抗体，并能与相应抗体发生特异性结合的物质，称为抗原。抗原具两方面的内容：抗原性（免疫原性）和反应原性。（1）抗原的基本性质：

①异物性②大分子量

③特异性：（2）抗原的种类①按抗原的完整性及其在机体内刺激抗体产生的特点分为：完全抗原半抗原②按抗原结构分：以细菌为例，可分为菌体抗原鞭毛抗原表面抗原菌毛抗原外毒素和类毒素2、抗体：抗体是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，亦称免疫球蛋白（Ig）。含有免疫球蛋白的血清，通常称为免疫血清或抗血清。（1）抗体的基本性质①抗体是一些具有免疫活性的球蛋白，具有和一般球蛋白相似的理化性质。生产上常用硫酸铵从免疫血清中沉淀免疫球蛋白，以提取抗体。②抗体在试管内能与相应抗原发生特异性结合，在机体内能在其他防御机能协同作用下，杀灭病原微生物。③抗体的分子量都很高，在15万至100万之间。最大的是IgM，分子量为90万。

（2）抗体的种类①根据抗体获得方式分：

免疫抗体：天然抗体：自身抗体：②根据抗体作用对象分：

抗菌性抗体：抗毒性抗体：抗病毒性抗体：过敏性抗体：③根据与抗原在试管内是否出现可见反应而分为：

完全抗体：不完全抗体：二、血清学反应抗原和抗体之间相互作用的反应，称为血清学反应。

1、血清学反应的一般特性：（1）特异性和交叉性（2）可逆性（3）结合比例（4）敏感性（5）阶段性2、影响血清学反应的因素（1）电解质：（2）温度：（3）pH：三、血清学反应的种类1、凝集反应

细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在适量电解质存在的条件下，抗原抗体发生特异性结合，且进一步凝集成肉眼可见的小块，称为凝集反应。其参与反应的颗粒性抗原称为凝集原，参与反应的抗体称为凝集素。该类反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。（1）直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。测定方法有玻片法和试管法。玻片法：这是一种定性实验方法。将含有已知抗体的诊断血清和待检菌液各一滴在玻片上混合。数分钟后，如出现肉眼可见的细菌凝集现象，即为反应阳性。此法简便、快速，适用于菌种的鉴定和血型测定。试管法：这是一种定量方法。在一系列试管内，加入不同稀释度的等量待检血清（用生理盐水稀释）和等量的抗原，放在37℃或56℃水浴内，4h后观察结果，再放入冰箱过夜，然后再观察一次。血清的最高稀释度仍有明显可见的凝集现象，即为血清的抗体效价。效价越高，抗体含量越多。（2）间接凝集反应：间接凝集反应又称被动凝集反应。其基本原理是将可溶性抗原吸附在适当的载体上，使其形成“颗粒性抗原”，从而可使用凝集反应加以肉眼检出。由于这种凝集是借助于载体颗粒，使原来不发生凝集反应的抗原抗体发生结合，出现肉眼可见的凝集现象，故称为间接凝集反应。载体颗粒的作用是增大了抗原的反应面积，因而能使众多的复合物凝集成团。间接凝集反应的灵敏度比直接凝集反应高10~400倍。常用作载体颗粒的物质有红血球、白陶土、聚苯乙烯乳胶颗粒、活性炭等。

将可溶性抗原与抗体混合，充分作用后再加入载体吸附的相应抗原，此时若抗体已被中和，则不再发生凝集，这种反应称为间接凝集抑制反应，用于检测抗原。检测方法是先将标本与抗体作用，然后再加入与抗体相应的致敏载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在与致敏载体相同的抗原，抗体在前一步未被中和，因此与后加入的载体上的抗原起作用，若标本中存在与致敏载体上相同的抗原，则凝集反应被抑制。2、沉淀反应可溶性抗原（蛋白质、多糖或类脂溶液、血清、细菌抽提液，组织浸出液等）与其相应的抗体在合适的条件下反应并出现沉淀物的现象，称为沉淀反应。参加反应的可溶性抗原称为沉淀原，参加反应的抗体称为沉淀素。由于沉淀原的分子小，表面的抗原决定簇相对较多，因此一般先要稀释抗原才能获得产生沉淀反应所需要的合适的抗原与抗体比例。常用的沉淀反应类型：（1）

环状沉淀反应：又称环状沉淀，是一种试管法。先在小口径试管内加入已知抗血清，然后仔细将待检抗原加在血清层之上，使两层界限分明。凡数分钟后在界面上出现白色沉淀环者，为阳性。此法可用于抗原的定性，如法医学上鉴定血迹，食品卫生上鉴定肉的种类，以及作病畜炭疽检验的Ascoli氏试验或媒介昆虫的嗜血性检验等。（2）絮状沉淀反应：又称絮状反应。将抗原与相应抗体在试管内或凹玻片上混匀，经一段时间即可出现肉眼可见的絮状沉淀颗粒，即阳性反应。诊断梅毒的康氏试验和测定抗毒素的絮状沉淀单位都用此法。（3）

琼脂扩散反应：又称免疫扩散试验。其原理是可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内从高浓度向低动度自由扩散，当二者相遇时，如果抗原与抗体相对应，且比例适当，又有适当电解质存在，则可在相遇处出现肉眼可见的沉淀线，为阳性反应。沉淀物在半固体琼脂中可长时间保持固定位置，不仅便于观察，而且可以染色保存。另外沉淀线对于形成它的抗原抗体有特异的不透过性，而对于其它的抗原和抗体是可以透过的，所以每一条线则代表了一种抗原抗体的沉淀物。因此，琼脂扩散试验的最大特点是可以对试验中不同的抗原、抗体系统进行分析研究，并具高度敏感性和特异性，另外由于它设备简单，操作方便，因此得到广泛应用。琼脂扩散法分为单向扩散和双向扩散两种基本类型。a.单向扩散：将适当浓度的抗体预先混合于生理盐水琼脂中，倾注平板或玻片上，待琼脂凝固后打孔，然后向孔中加入一系列不同浓度的标准抗原或待测抗原，在合适的温度、湿度环境中，经过一定时间，抗原由小孔向四周扩散，与混匀在琼脂中的抗体相互作用，在浓度比例合适处，孔周围形成清晰的白色沉淀环，沉淀环的直径与抗原浓度成正比。所以，如果事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则可从标准曲线中查出未知样品中的抗原含量。此法灵敏度高，主要用于定量测定各种免疫球蛋白及亚类和补体成分的含量。b.双向扩散：双向琼脂扩散试验是对抗原或抗体作定性分析的方法。分析时将加热融化的半固体琼脂在玻板上浇成薄层，冷凝后，在琼脂板上打出多个小孔。抗原抗体分别注入小孔中。如抗原、抗体相互对应，浓度、比例比较适当，则一定时间后在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。双向扩散法可用于分析溶液中的多种抗原。不同抗原由于化学结构、分子量、带电荷情况的不同，在琼脂中的扩散速度有差别。扩散一定时间后便彼此分离了。分离后的抗原与其相应抗体在不同部位结合，在两者分子比例适合处形成沉淀线。而且一对相应的抗原、抗体只能形成一条沉淀线。因此根据沉淀线的数目可推知溶液中有多少种抗原成分。根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。3、免疫电泳：这是一类将琼脂扩散和电泳技术结合而发展起来的血清学检验方法。常用的有对流免疫电泳、火箭电泳和琼脂免疫电泳。(1)

对流免疫电泳：对流免疫电泳是将双向扩散和电泳技术相结合的一种方法。其原理是在通电的琼脂中，抗原和抗体向相反的方向移动，两者相遇于最适比例时形成白色沉淀线。方法是用pH8.6的碱性巴比妥缓冲液配成半固体琼脂板，待冷凝后打孔，抗原加入阴极端小孔，抗体加入阳极端小孔，通电后抗原与抗体在电场作用下，向相反方向移动，抗原抗体在电泳时，都会受到电渗作用的影响（电渗是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动，琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中进行电泳，带负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样溶液就向负极移动，产生电渗），由于一般抗原等电点约为pH4~5，所带负电荷较多，分子量小，所以能克服电渗力的影响向正极移动。而抗体球蛋白的等电点为pH6~7，故在pH8.6的缓冲液中带负电荷少，其分子量大，移动缓慢，不能克服电渗的影响，因而向负极移动。抗原向正极移动，抗体向负极移动，二者相遇，形成白色沉淀线。(2)火箭电泳：又称电泳免疫扩散，这是将单向扩散和电泳结合在一起的方法。抗原在含定量抗体的琼脂中向一个方向移动，两者比例合适时，在较短时间内生成火箭状或锥状的沉淀线，故称火箭电泳。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。(3)琼脂免疫电泳：这是一种将单向电泳和双向扩散结合起来的一种血清学检验技术。在用适当缓冲液配制的琼脂平板上打孔，加入抗原样品后进行电泳，由于不同的抗原组分所带电量不同，电泳迁移率不同，故可通过电泳将不同的抗原组分分离成区带。然后沿电泳方向挖一条抗体槽，加入与抗体相应的血清双向扩散。已分离成区带的抗原与抗体在琼脂中扩散而相遇，在两者比例适当之处形成肉眼可见的沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，即可分析样品中所含的抗原组分、含量和性质。4、补体结合反应：这是一种有补体参与并以溶血现象作为指示的抗原抗体反应。参与本反应的有5种成分，分两个反应系统，一为检验系统（溶菌系统），包括已知抗原（或抗体）被检抗体（或抗原）和补体；另一为指示系统（溶血系统），包括绵羊红细胞、溶血素和补体。补体是一组球蛋白，存在于动物血清中，本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合，但不能与单独抗原或抗体结合。被抗原抗体结合的补体不再游离。试验时，先将抗原与血清在试管内混合，然后加入补体。如果抗原与血清相对应，则发生特异性结合，加入的补体被抗原抗体复合物固定。如果抗原与抗体不对应，则补体仍游离存在。因补体是否已被抗原抗体复