第八章体内中药制剂分析

第八章

体内中药制剂分析2023/1/15背景

中药制剂成分复杂，尤其是对许多化合物的结构与性质还未能了解。目前中国有复方丹参滴丸、血脂康等10种中药处方药正式向美国FDA申请检测认证，其中有7种进入二期临床试验，其余3种正启动一期临床试验。但迄今为止尚未有中药通过美国FDA认证而进入药品流通。中药制剂要想被国际医学界认可并接受，关键在于如何采用现代科学技术手段探明中药作用的物质基础、相互作用机制，为传统中药赋予现代科学的内涵。活性成分相互作用机制体内动态变化规律背景中药制剂体内中药制剂分析技术背景体内中药制剂分析，研究其活性成分的吸收、分布、代谢、排泄、立体选择性、药物的相互作用、药物对内源性代谢的影响，阐明中药制剂的作用机制，为中药新药研究提供了新的途径。体内中药制剂分析技术：核磁共振技术（NMR）、色谱质谱联用技术（如GC-MS、LC-MS/MS）、分子生物学技术（如酶联免疫吸附、化学发光免疫、荧光免疫方法）等。本章内容提要生物样品制备及贮存生物样品预处理生物分析方法建立及验证1.生物样品制备及贮存

1.生物样品制备及贮存

1.1概念生物样品是指来自于生物机体的各种体液及组织的样品，如：血液尿液唾液脑脊液胆汁胃液脏器淋巴液组织（一）血样1.2常见生物样品的制备及贮存

血浆血清全血自行凝固、静置、离心+抗凝剂、静置、离心SerumPlasma+抗凝剂、混匀Wholeblood（不含纤维蛋白原）（含血细胞）问题：有哪些应用？应用及贮存血清多用于血液生化、免疫等方面的测定；血浆多用于凝血等方面的测定；全血则多用在血细胞、血常规、血沉等方面的测定。关于贮存：血清、血浆视情况分装后-20℃或-80℃备用。（二）尿样临床常用尿液标本种类：晨尿、随机尿、计时尿。关于贮存：应尽量及时新鲜标本检测,如不能即刻检查，应-20℃或-80℃备用。（三）组织样品应用及贮存2生物样品的预处理提取分离释放待测成分减少杂质干扰使待测成分达到检测限度结合物或络合物富集常用生物样品种类：血浆、血清、组织；采用蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术；

蛋白沉淀法因操作简单，在满足分析条件的情况下，应首先考虑该方法。关于贮存：应尽量及时新鲜标本检测,如不能即刻检查，应-20℃或-80℃备用。3生物样品分析方法的建立及验证

分析方法的设计依据在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。检索文献，可在最短时间、最小的花费建立一个好的分析方法！这是试验前要做的第一件事！

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PubMed是因特网上使用最广泛的免费MEDLINE，是美国国家医学图书馆(USNationalLibraryofMedicine,NLM)所属的国家生物技术信息中心(NCBI)于2000年4月开发的，基于WEB的生物医学信息检索系统,它是NCBIEntrez整个数据库查询系统中的一个。PubMed界面提供与综合分子生物学数据库的链接，其内容包括：DNA与蛋白质序列，基因图数据，3D蛋白构象，人类孟德尔遗传在线，也包含着与提供期刊全文的出版商网址的链接等。

3.1分析方法的选择生物样品中的药物浓度—决定分析方法的首要因素；待测组分的理化性质、体内的存在形式及组分在生物体内的生物转化(代谢)途径也是分析方法的重要影响因素，如：药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等—决定预处理方法及萃取方法；具有亲脂性—在适当的pH值下用溶剂萃取；具有强极性或亲水性—沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等；具有挥发性—GC测定法；具有光谱或电化学特性—分析检测方法；对酸碱不稳定—避免使用强酸或强碱性溶剂；对热不稳定—避免高温蒸发溶剂。体内药物分析常用分析方法见p201表8-2。目前，常用分析方法：（1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如HPLC、GC法或LC-MS、GC-MS法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%的药物浓度测定可以用色谱法来完成。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。GC/MS分析气相色谱和质谱(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。GC/MS要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因此，分析物必须具有挥发性，或能够经过化学衍生具有挥发性。LC/MS分析液相色谱可以分离无挥发性和未衍生化的代谢物。因此，LC/MS可以分析的化合物种类范围比GC/MS更广。常用LC/MS分析的样品包括氨基酸（20种氨基酸中的18种可以衍生，其余两种不能）和比三糖更大的糖。最适合作为未知代谢物研究中的探索方法，或者在多种目标代谢物由于挥发性问题不能用GC/MS进行分析时采用。化合物分类及其最适的分析技术

3.2生物样品分析方法的建立

初步拟定分析方法后进行一系列试验，通过：（1）选择最佳分析条件(即分析条件的筛选)；（2）验证分析方法的可行性；以确认是否适用于实际生物样品(一)分析条件的筛选

取标准物质，照拟定的分析方法(不包括生物样品的预处理)测定，确定最佳分析检测条件和检测灵敏度。 如色谱分析时：调整检测器(类型、条件)、色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒径、柱长度)、流动相(组分及其配比)及其流速、柱温、进样量、内标物的浓度及其加入量等条件，使各物质具有良好的色谱参数(理论塔板数n、分离度R、拖尾因子T)和适当的保留时间(tR)，

目的：避开其他物质干扰，且待测物与内标物峰面积比适当，并通过选择适当检测器，获得好的方法灵敏度。(二)分析方法的建立

分析方法建立时，分为以下步骤：

1．空白溶剂试验

—溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验

—(方法特异性) 3．模拟生物样品试验

—方法效能指标

4．实际生物样品测试—代谢产物(方法特异性)1．空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）：

采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）后，测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）。考察目标

—方法的特异性；

—空白值应尽可能小，并能有效校正。对色谱分析法而言

—可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型

—空白试剂信号应不干扰待测物的测定（如R＞1.5）

本步骤主要考察

—需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验。2.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) —如空白血浆

—照“空白溶剂试验”项下方法进行预处理并检测 考察目标

—生物基质中内源性物质对测定的干扰；（方法特异性）

—在待测组分(或特定的活性代谢物、内标物质等)的信号处不应出现内源性物质信号。3.模拟生物样品试验

模拟生物样品(又称质量控制,QC样品)—空白生物基质中加入待测药物，照“空白溶剂试验”项下方法操作。

考察目标：

—方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、药物的提取回收率等指标；

—同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性。对色谱分析法而言

应进一步考察待测物(或内标物)与内源性物质的分离情况

—如色谱峰的tR、n和T是否与水溶液的一致、色谱峰是否为单一成分（如何确定？）、标准曲线的截距是否显著偏离零点等； 以上均可以说明内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰。4.实际生物样品的测试通过空白生物基质和模拟生物样品试验所确定的分析方法及其条件,不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定，其原因：

—药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)等。在建立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试。考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干扰情况，以进一步验证方法的可行性。3.3生物样品分析方法的验证

基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：

(1)生物样品量少(2)待测组分浓度低(3)内源性物质的干扰(4)生物的个体差异较大

从而确保分析方法的重现性和可靠性。验证步骤

首先为分析方法的验证

—专属性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性

其次为生物基质中待测药物稳定性的验证

—室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环（Freeze-and-thawcycle）

分析方法的验证

1、专属性(Specificity)2、标准曲线和定量范围（CalibrationCurve）3、定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）4、精密度与准确度（PrecisionandAccuracy）

5、样品稳定性(Stability)6、提取回收率7、方法学质控8、微生物学和免疫学方法确证（一）方法专属性(specificity)

—又称特异性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用，系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物的能力。 要求所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有； 要求待测物与其代谢物加以区分(分离)的能力；

如果专属性不佳，方法的准确度、精密度、线性都将受到影响。因此确保专属性是建立和验证一个分析方法的第一步。

考察一个分析方法是否具有专属性，应着重考虑以下几点：

1.内源性物质的干扰比较—待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）

—如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致 及与内源性物质色谱峰的R

确证—内源性物质对分析方法有无干扰2.代谢产物的干扰

比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的R

如HPLC色谱峰的tR、n和T〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰

结构已知的特定活性代谢物的测定 －通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性

对于结构未知的代谢产物的测定 －采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况3.联合药物的干扰

TDM时（治疗药物检测）

—还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致

来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况4.与参比方法的相关性

除上述方法外，有时还可使用参比方法对照 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法，如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X);拟定方法结果为纵坐标(Y)

用最小二乘法计算回归方程Y＝a＋bX(坐标标度相等)、相关系数(r)—表示两种方法测得结果的一致性，若r≠1，表示拟定方法为非线性，如RIA中抗血清滴度选择不当。4.与参比方法的相关性

Y＝a＋bX

截距(a)—表示拟定方法受到恒定干扰的程度—内源性物质(UV)

斜率(b)—表示拟定方法受到比例干扰的程度—标记抗原不纯(RIA)

与参比方法的相关性比较—除显示分析方法的特异性外

—斜率b表示两种方法测得结果的一致性

若参比方法准确度良好，且截距a≈0,则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)（二）标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve） —生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度），通常用回归分析方法所得的回归方程来评价。

—除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式。

—回归分析法为最小二乘法（leastsquares）或加权最小二乘法（weightedleastsquares）（线性范围较宽时使用加权法）。

线性范围（linearrange）—标准曲线的最高与最低浓度的区间。

—模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度（二）标准曲线与线性范围(续)

标准曲线—用至少5个浓度的标准模拟生物样品建立；

—建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备。线性范围

—不包括零点，应能覆盖全部生物样品中的药物浓度；

—不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度。

标准曲线的一般建立方法标准系列溶液的制备内标溶液的制备标准系列模拟生物样品的制备标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求标准曲线的一般建立方法

1.标准系列溶液的制备标准物质—对照品、标准品 溶剂—水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度—模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异 浓度较低—应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀

至少含5～8个浓度点(不包括零点,即空白) —可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为2)

若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5

设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)2.内标溶液的制备内标物质－对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂－甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度－与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，则内标的浓度应配制成40μg/ml3.标准系列模拟生物样品的制备

空白生物基质(如血浆)—加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失

——①先加入标准溶液②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀

①②③实验中的注意事项：1、标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的10％～5％。2、应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质后混悬。3、标准溶液加入到试管中后，应先挥干溶剂再加入空白生物基质。（三）定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度,又称为方法灵敏度(sensitivity) —标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求—应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax的10％～5％) —其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内 —RSD≤20%最低检测限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下识别样品中药物的最低浓度，一般认为信噪比（S/N）≥3，信号可被检测，故以S/N＝3时的样品浓度作为LOD.LOQ的检测信号至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作为LOQ的估计值。注意（四）准确度

方法准确度(accuracy)

—系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度。

—应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定（质控样品）。

—一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示1.测定法

取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(qualitycontrol，QC)样品

—高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度

—每一浓度至少5个样本

—与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次

2.结果计算与限度要求

计算

—测定值M(measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求

—相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%)

（五）精密度

方法精密度(precision)

—系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度

—表示该分析方法的可重复性(reproducibility) —反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) —使用模拟生物样品测定1.表示方法

方法精密度一般用标准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= =批内(within-run或intra-assay)RSD—日内(within-day)批间(between-run或inter-assay)RSD—日间(between-day，day-to-day)2.测定法—分别测定法(Ⅰ)

照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定

批内RSD

—每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD

批间RSD

—每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD2.测定法—连续测定法(Ⅱ)

若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为5～6个样本)—方差分析法 批间RSD=

批内RSD= =3.限度要求

在药代动力学和生物利用度研究中

对g/ml级水平的RSD一般应≤10% ng/ml级水平的RSD一般应≤15%

在LOQ附近RSD应≤20%。

（六）样品稳定性在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠。

方法稳定性考察

生物样品的稳定性考察相关稳定性的测定方法与要求生物样品的稳定性短期稳定性主要考察模拟生物样品在室温、4℃或－20℃以及冻－融循环条件下的稳定性长期稳定性主要考察生物样品长期冰冻（－20℃或－80℃）后的稳定性测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的±5％以内（经衍生化处理±15％以内）。若考察时间大于1天，则应与新制QC样品比较，若考察时间很长，可与反复在液氮中保存的样品在相同条件下的测定值比较2、稳定性期限要求室温下－1个工作日（1、2、4、8、24）冰箱中－数个工作日（数星期、数月）（七）提取回收率

主要考察生物样品的预处理方法对待测组分的影响及损失情况。1.测定法

取空白生物基质(如血浆)，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AT—经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS—未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)2.限度要求在生物利用度或TDM时高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应≥50%高、中浓度的RSD应≤15%低浓度的RSD应≤20%内标法中内标物质的提取回收率应≥50%（RSD≤15%)（八）质量控制该内容主要目的是用来在实际生物样品的测定过程中对分析数据的质量进行监控1、质控样品（QualitycontrolQC）：是指将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品，用于整个分析过程中的质量控制，一般配制高、中、低三个浓度的样品质控样品池由不负责生物样品测试的人员在实验开始时制备，并与实际生物样品在相同条件下储存2023/1/15体内药物分析792、质量控制（1）测定法：在测定过程中，每批生物样品都应建立随行的标准曲线，并随行间隔以高→低或低→高测定高、中、低至少3个浓度的6个QC样品（2）限度要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80％～120％，RSD≤20%,允许由2个QC样品超出各自的±20％第四节体内药物分析方法

应用示例

第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究

一、文献调研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。

2023/1/15体内药物分析80药动学参数吸收过程—空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%～70%Cmax—口服500mg后平均Cmax为2.4～2.6mg/LTmax—1～2hT1/2—血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h蛋白结合率—0%～40%代谢—口服给药24h内，40%～50%原形、15%代谢物经肾排出2023/1/15体内药物分析81体内分析方法

RP-HPLC

色谱柱—ODS色谱柱 流动相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.3～3.5)，或离子对色谱:溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵)

检测—紫外或荧光检测

生物样品预处理 蛋白沉淀法—甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法—二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂 蛋白沉淀-溶剂萃取—乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取

2023/1/15体内药物分析82二、分析方法设计

1．分析方法 血浆蛋白结合率低(20%～40%)、以原形从肾排泄 生物等效性研究—测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法

2．检测方法 紫外—灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求

荧光—灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求

2023/1/15体内药物分析83

3．样品制备方法 初步拟定—采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析 预试—含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低)

经进一步试验，确定为： 血浆0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取→60℃氮气流吹干→流动相200l溶解→20l进样 灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax＞2g/ml)

2023/1/15体内药物分析84三、实验方案

1．给药方案

20名受试者随机分为两组，每组10人 第1次试验—第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂 第2次试验—第1次服药后第7天开始，两组交换给药2023/1/15体内药物分析85

2．血样的采集与处理

分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(5～7个t1/2)小时 由肘正中静脉取血4ml

立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆，-20℃冰箱中保存待测2023/1/15体内药物分析86

3．血样分析法

色谱条件

—高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为KromasilODS-AP(200mm×4.6mm，5m)

—流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min

—检测波长为ex=277nm，em=445nm

—柱温为40℃。

2023/1/15体内药物分析87

3．血样分析法 血浆样品的预处理 取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60℃下氮气流吹干，残渣加流动相200l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20l进样2023/1/15体内药物分析88四、分析方法验证

1．方法特异性

环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰。志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代谢物有干扰2023/1/15体内药物分析89

2．标准曲线

标准系列溶液——取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的标准系列溶液，冰箱保存 标准系列模拟血浆样品——取空白血浆0.5ml，加环丙沙星标准系列溶液各50l，配制成相当于浓度为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/ml的QC样品，冰冻(-20℃)

测定法——取QC样品，照“血浆样品的预处理”项下方法操作，以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法经Excel运算，求得的直线回归方程为：Y=1.33·C-0.02583，R2=0.9951(C=0.1～5.0g/ml)

3．方法精密度与准确度

QC样品—浓度为0.1、0.5和2.0g/ml

分析批次—3批，每批5样品 测得浓度—0.0988、0.4537和2.128g/ml

准确度RE(%)—-1.2%、-9.3%和6.4%

精密度 批内(%)—6.7%、4.6%和3.9%

批间(%)—8.9%、9.6%和12.3%2023/1/15体内药物分析91第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求2023/1/15体内药物分析92

4．方法定量限 受试制剂和参比制剂的Cmax分别为

—3.2020.496和3.3000.730g/ml

方法的LOQ为0.1g/ml＜0.16g/ml(Cmax的1/20)

—准确度和精密度均符合要求：RE为-1.2%

日内RSD为6.7%

日间RSD为8.9%2023/1/15体内药物分析93第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3血浆冰冻血浆冻融残渣冷藏室温放置时间（d）As/Ai循环次As/Ai时间（d）As/Ai时间（h）As/Ai02.728604.3