细菌内毒素检查技术应用与发展

细菌内毒素检查技术的应用与发展赵金锁2016.4.31.热源分类—按检查法区分1：内毒素热源—革兰氏阴性细菌细胞壁的组分2：非内毒素热源—除内毒素外的热源2热源的检查方法2.1体内热源的检查方法—兔温法（PT）.是一种体内、全热源的检查方法.1942年USP12版第一次收载该法.各国药典至今仍然使用该发2.2体外热源检查法（IPT）.是一种体外的利用人血细胞反应的全热源原检查法。.在2000年前，尚未有药典收载该法，但欧洲药典在2005年后率先收载该法。.IPT有取代PT的趋势2.3细菌内毒素检查法（BET）.热源=内毒素？学术上的争论.医药工业接受的观点—控制内毒素污染就等于控制热源污染3历史回顾—鲎试剂的发明与BET的应用.1956年，美国科学家F.Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象，从而拉开了BET研究与应用的帷幕。

4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.1BET取代PT成为必然的趋势.1980年USP收载BET法，但未规定任何品种应用，1999年USP版规定670种药品作BET项，仅约20种药品保留PT项。.1993年CP1990版增补本收载BET法，同样未涉及任何品种使用，CP2000年版有近70个品种规定作BET项。CP2005年版有超过150种药品规定作BET项。.其它国家药典对药品的BET项，同样经历了从无到有，从少到多的过程。BET取代PT是已成为必然的趋势。4.2走向统一的BET发已成为发展的趋势.在初期各国颁发的BET不尽相同，影响药品的流通。.USP、EP及JP率先统一BET法，于2001年1月1日起实施。.CP2005年版BET法的修订，基本参照USP、EP及JP的统一BET法。4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.3BET技术及应用的发展特点4.3.1BET方法学呈多样化.凝胶法—最经典的方法.光度法（浊度法和显色基质法）4.3.2BET方法的选择.供试品检测时可以选择任何一种方法进行试验.当两种测试结果有争议的时候，除另有规定外，以凝胶法结果为准。.试验用BET水及器皿的要求：凝胶法，BET水内毒素应小于0.015EU/Mml，光度法，BET水内毒素应小于0.005EU/ml。所用器皿应用干热灭菌法（250℃，不少于0.5h）去除热源，若使用塑料器械，应选用无内毒素及对试验无干扰的器械。

4.BET技术与应用的发展趋势与特点4.4BET方法趋向自动化.凝胶法BET—在自动化方面没有新的发展—孵育设备方面，干式恒温器逐渐取代恒温水浴槽.定量法BET—试管式定量检测仪（32-108孔），如Ati-320动态试管仪—酶标板式定量检测仪（96-384孔）—单波长/多波长/可变波长测定仪（300-1000nm）—专用数据处理软件5凝胶法实验技术5.1实验准备5.1.1凝胶法的实验程序a：试验准备：试剂、仪器及用具等b：确定药品的细菌内毒限值（L)c：选择鲎试剂的灵敏度（λ）d：计算供试品的最大有效稀释倍数（MVD）或最低有效浓度（MVC）e：鲎试剂灵敏度复核f：干扰实验的验证g：供试品日常的内毒素限量检查5.1.2实验材料和器具a：仪器设备：37℃恒温水浴或适宜的恒温器b：器具：要除热源处理c：试剂：鲎试剂具有国家生产许可证。5凝胶法实验技术5.2鲎试剂的灵敏度复核试验5.2.1过程：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品用BET水溶解，在漩涡混合器上混合15min，然后稀释制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的4个浓度的细菌内毒素标准溶液，注意，每稀释一次要在漩涡混合器上混合30s，取鲎试剂18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的细菌内毒素标准溶液，每一个细菌内毒素标准溶液平行做4管，另2管加入BET水作为阴性对照，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60min±2min。5.2.2阳阴性判断：试验结束后，将试管轻轻取出，缓缓倒转180度，若管内形成凝胶且不变形不从管内滑脱者为阳性。未形成凝胶或者形成凝胶不结实、变形并从管内滑脱者为阴性。注意，操作过程要轻拿轻放，避免因震动造成的假阴性结果。5.2.3结果判断：当最大浓度管（2λ）为阳性，最小浓度管（0.25λ）为阴性，阴性对照管为阴性，该试验有效。计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），当λc在0.5λ～2.0λ时方可进行细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。5凝胶法实验技术5.3供试品的干扰试验5.3.1目的：判断某种检品在某种浓度下下是否适合作细菌内毒素检查。5.3.2原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品溶液中进行的差异，也就是比较反应在不同介质中进行反应的差异，无差异即无干扰，有差异即有干扰。若没有干扰，该浓度下可以进行日常检查，若有干扰，则必须排除干扰后才能进行日常检查。5.3.3何种情况下需要做干扰试验？.新品种建立方法.鲎试剂的来源改变.鲎试剂的配方、生产工艺改变.供试品的来源改变.供试品的配方、生产工艺改变.试验环境中发生了其它任何有可能影响试验结果的变化。5凝胶法实验技术5.3供试品的干扰试验5.3.4干扰试验的程序与方法

按下表制备溶液A,B,C,和D，供试品溶液的溶度为不得超过MVD的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下进行。编号细菌内毒素/被加入内毒素溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度管数A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λλ0.5λ0.25λ4444C2λ/BET水BET水12482λλ0.5λ0.25λ2222D无/BET水———25凝胶法实验技术5.3供试品的干扰试验5.3.4程序和方法（接上）

上表中A为供试品溶液，B为干扰试验系列，C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列，D为阴性对照

只有当A和D为所有平行管为阴性，C的结果在鲎试剂灵敏度范围内，试验方为有效。计算C和B反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。Es=antilg（∑Xs/4）Et=antilg（∑Xt/4）

上式中Xs和Xt分别是系列溶液C和系列溶液B反应终点浓度的对数值（lg）

当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es之间时，认为供试品在该浓度下无干扰。5凝胶法实验技术5.4凝胶法试验技术检查法5.4.1凝胶限度试验

按下表制备溶液A,B,C,D，使用稀释倍数为MVD并以排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B，按鲎试剂灵敏度复核项下操作。

注A为供试品溶液，B为含供试品的阳性对照，C为阳性对照，D为阴性对照。编号内毒素的浓度/被加入内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/BET水2D无/BET水25凝胶法实验技术5.4.1凝胶法限度试验结果判断：保温60min后观察结果：若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，阳性对照C的平行管均为阳性，含供试品阳性对照B的平行管均为阳性，试验有效。A平信管数均为阴性，结果判断为符合规定，若A均为阳性，判断供试品为不符合规定，若A一管为阳性一管为阴性，需进行复测，复测时A需要平行4管，若4管均为阴性，判定符合规定，否则，判定不符合规定。5.4.2凝胶半定量试验：参照药典。6光度法测定6.1广度测定法的分类a：浊度法：终点浊度法动态浊度法b：显色基质法：终点显色法和动态显色法6.2标准曲线的可靠性验证

方法：用标准内毒素制成系列溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度稀释倍数不得大于10倍，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限），每稀释一步的混匀时间和凝胶法一样，每一浓度至少做3支平行管，同时做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于系列浓度中最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归，当线性回归系数R大于0.98时，该试验有效。6.3干扰试验

选择标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度（λm）作为干扰试验中添加的内毒素浓度，按下表制备溶液A、B、C和D。光度法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液至少2B标准曲线的中点浓度供试品溶液至少2C至少3个浓度（最低一点设定为λ）BET水每一浓度至少2D无BET水至少2A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液B为标准曲线的中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。C为可靠性试验项下描述的用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。D为阴性对照计算方法：按回归方程计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，计算回收率（R）：R=（Cs-Ct）/λm×100%

当内毒素的回收率早50%～200%之间，认为该实验室条件下供试品溶液不存在干扰。6.4检查法

按光度测定法的干扰试验操作步骤进行检测，使用系列溶液C生成的标准曲线计算溶液A的每个平行管的内毒素浓度。(1：要符合可靠性试验，2：无干扰，3：溶液D反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间）结果判断：供试品所有平行管的内毒素浓度乘以稀释浓度后，小于规定的内毒素限值，判断为符合规定。大于或等于规定的内毒素限值，判断为不符合规定。7举例说明7.1凝胶法测定头孢唑肟钠的细菌内毒素（≤0.1EU/mg）

假设鲎试剂的灵敏度0.25EU/ml，则计算MVC=0.25/0.1=2.5mg/ml

首先验证并确定2.5mg/ml浓度下无干扰，进行一下试验。按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/BET水2D无/BET水2

7动态浊度法举例说明7.2动态浊度法7.2.1实验用器具：

反应试管：8×75mm硼硅酸玻璃试管

稀释试管：大口径硼硅酸玻璃试管

移液器具

其他：酒精灯、镊子、砂轮片，标记笔或纸，计时器。

注意：所有与试剂或供试品接触的器具必须经除热源处理。7.2.2实验用仪器

电热烘箱，漩涡混合器，动态试管仪7.2.3供试品：

复方氨基酸注射液25g/500ml

内毒素限值L≤0.5EU/ml7.3标准曲线的可靠性试验7动态浊度法举例说明7.3.1标准曲线内毒素浓度的选择a：至少3个浓度b：相邻浓度间隔不大于10倍c：所有浓度不超过所用TAL的标示检测范围。d：本实验选择标准曲线浓度为2.0,0.25,0.03EU/ml，即E2，E0.25，E0.037.3.2标准曲线的制备1）开启动态试管仪预热2）制备CSE系列溶液CSE（80EU/瓶）E40E10E2E0.25

E0.03

注意：每进行下一步稀释前溶液须在漩涡混合器上混合至少30秒。3）打开动态试管仪工作软件，进入“数据采集”界面，选择“动态浊度法”，设置反应时间为60分钟，点击“开始采集”2.0ml0.8ml2.4ml0.8ml3.2ml0.5ml3.5ml0.5ml3.5ml4）反应项目设置及加样（注意：内毒素标准溶液在加样前须漩涡混合至少1分钟）项目平行管每反应试管加样量

阴性对照（NC）20.1mlTAL+0.1mlW内毒素标准（EU/ml）0.0330.1mlTAL+0.1mlE0.030.2530.1mlTAL+0.1mlE0.252.030.1mlTAL+0.1mlE25)把已加样的各反应试管逐一在漩涡混合器上清点一下，使试管内的混合物混匀，然后把试管逐一插入动态试管仪中，仪器即自动开始数据采集。（注意：试管要一次性插到底，插入后不得再触碰或转动，否则会使该试管的数据作废）6）在软件的“数据采集”界面中填写相应的试验参数，如试验员，实验试剂，等，也可以在加样反应前填好。7）反应结束后，点击“数据保存”，退出“数据采集程序”。7.3.3数据分析1）进入软件的“数据分析”程序，调出贮存的数据文件。2）点击回归类型“平均回归”，将显示出标准曲线的全部数据。3）点击“检测报告”，将显示出本实验的全部数据。4）数据分析：CR小于10%方为有效。7.4干扰试验7.4.1供试品：复方氨基酸注射液7.4.2选择标准曲线的浓度本实验选择标准曲线的浓度为2.0,0.25,0.03EU/ml（E2，E0.25，E0.03),检测灵敏度λ=0.03EU/ml（E0.03），标示曲线中点浓度λm=0.25EU/ml（E0.25），7.4.3计算MVDMVD=L/λ=0.5/0.03=16（倍）

一般来讲，只需要选择一个稀释倍数不超过MVD的供试品浓度作干扰试验，但如果不知道什么浓度合适，需要同时对供试品的几个浓度作干扰试验，以便找出一个合适的浓度，这就是干扰试验的初筛试验。本实验选择供试品的2倍（S2），4倍（S4），8倍（S8)稀释浓度作为干扰初筛试验。7.4.4实验需要制备的溶液

编号溶液内容及作用A稀释倍数不超过MVD的供试品溶液，本试验为S2，S4，S8B加入λm内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液，在本实验为S2E2，S4E0.25，S8E0.03（含供试品的阳性对照）C用于制备标准曲线的内毒素溶液，在本实验为E2，E0.25，E0.03（阳性对照）DBET水（阴性对照）7.5各溶液的制备：1）开启动态试管仪预热2）制备C溶液

与7.3.22）制备CES系列溶液相同。