生物大实验绪论

生物学教学综合实验——绪论课程设计

碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定鸡胚生长发育植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定1.AKP蛋白表达与粗提2.阴离子交换层析3.分子筛层析4.AKP浓缩保存AKP的分离与纯化AKP抗体制备与检测AKP纯化参数测定酶活力测定蛋白质含量测定SDS鉴定AKP纯度和分子量

1.抗原－福氏佐剂混悬液的制备2.免疫小鼠3.收集腹水4.ELISA检测细菌AKP结构(蓝色为N末端红色为C末端)鸡胚生长发育1.种蛋的挑选2.孵化前准备3.孵化器孵化4.观察孵化过程并记录鸡胚的人工孵化鸡胚组织石蜡切片Real-TimePCR检测GAPDH

鸡胚组织RNA提取RT反应合成cDNAReal-TimePCR1.组织取材与固定2.石蜡包埋前处理3.石蜡包埋4.HE染色植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定转基因烟草的培养农杆菌的培养愈伤组织转化共培养筛选培养与分化转基因烟草的检测

采集叶片组织荧光体视镜观察对比未转化叶片上课安排时间任课教师实验准备周二（全天）席超、王健彭安，付鑫，郑键周四（全天）井健、李万杰彭安，付鑫，郑键上一学年本学年时间任课教师实验准备周二（全天）井健陈金波，？周四（全天）席超陈金波，？日期教学周实验内容2月28日2实验总论、配试剂、碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——准备分子筛柱3月6日3碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——表达、分子筛层析、准备离子交换柱3月13日4碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——分离纯化（硫铵沉淀）3月20日5碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——分离纯化3月27日6碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——纯化参数测定4月3日7清明节放假4月10日8碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定——电泳4月17日9小鼠腹水抗体的制备及ELISA检测——免疫小鼠鸡胚生长发育——观察（放培养箱）植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定——准备培养基生物学教育综合实验的教学安排4月24日10鸡胚生长发育——观察（课后观察，每天观察，不同小组观察不同的发育时期）植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定——脓杆菌诱导的转化（之后每3天换一次培养基，每次约2.5小时。换2周）鸡胚生长发育——取组织固定免疫组化切片（提供冰冻切片视频，学生课后自己观看）鸡胚生长发育——提RNA的准备5月1日11鸡胚生长发育——观察（课后观察，每天观察，不同小组观察不同的发育时期）鸡胚生长发育——石蜡包埋）鸡胚生长发育——Real-TimePCR小鼠腹水抗体的制备及ELISA检测——免疫小鼠5月8日12鸡胚生长发育——Real-TimePCR结果讲解鸡胚生长发育——石蜡切片看烟草愈伤组织生长情况5月15日13鸡胚生长发育——石蜡切片染色小鼠腹水抗体的制备及ELISA检测——免疫小鼠植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定——检测（GFP）5月22日14小鼠抗体的制备及ELISA检测——ELISA检测鸡胚生长发育——石蜡切片染色（照相）5月29日15生物学教育综合实验（小组汇报）6月5日16生物学教育综合实验（小组汇报）分子生物学实验指导（第二版）魏群主编高教出版社生物化学实验方法和技术（第二版）张龙翔等编著北京大学出版社生物工程技术实验指导魏群主编高等教育出版社最新分子生物学实验技术梁国栋主编科学出版社参考书实验技能40分实验报告20分实验态度和实验习惯等

20分

设计报告10分实验总结及体会10分实验成绩（100分）实验报告将包含下列一些科学文件的基本要点：标题页、摘要、引言、实验材料和方法、结果、讨论、结论、图表（如果有的话）。另外，请随实验报告交上实验记录本。实验报告20分，占你期末总分的20%。实验报告的评分标准：标题页（5％）摘要（中、英文，10％）引言（10％）材料和方法（10％）结果（20％）讨论（20％）结论（5％）图表（10％）实验记录本（10％）实验报告写作指南日常要求上课时间：上午8:00-下午5:00,提前5分钟进入实验室；请假须医院病假条或班主任签字的假条；上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西；实验课期间不许打闹、闲聊等，保持课堂纪律；随时保持实验台的整洁；认真作好值日工作，离开实验室须向教师声明；必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；

严格遵守实验室的各种规章制度；爱护实验器材；实验器材损坏必须按规定赔偿；用完仪器后必须复位；注意门窗水电的安全；在实验过程中一定要保持实验台面、地面、实验仪器有序、整洁和卫生日常要求每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生日常要求1、酒精灯的正确使用和维护液面高度、灯芯和火焰的调整。2、如何正确使用移液器。废tip的处理3、正确使用垃圾桶液体垃圾和固体垃圾的分离液体垃圾里飘浮着蓝色、黄色的tip4、如何正确使用离心机—试管类型、5、天平的使用和维护、检查平衡6、药品称量药品的污染和浪费7、正确环保的洗刷方法节约用水8、科学环保的灭菌消毒滤膜加报纸。9、如何保护自己戴手套、工作服10、吸水滤纸片有效利用减少浪费Troublemake11、酸度计的正确使用和维护将酸度计的探头和操作杆当搅拌棒使用。12、实验设计和报告的可“抄作性”13、如何正确使用通风橱及其存放的药品标签对号入座14、节约使用手套，减少塑料垃圾。15、如何清洁操作台和仪器平台天平所在的位置是否可以随便移动？好心办坏事16、酒精棉球的制作和使用。17、节约使用手套，减少污染垃圾。18、照胶的方向胶孔在上方19、在公用操作台上不自带垃圾桶或袋20、将称量滤纸当做卫生纸使用。Troublemake碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化及其分离纯化参数测定日期教学周实验内容2月28日2实验总论、配试剂、碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—准备分子筛柱3月6日3碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—表达、分子筛层析、准备离子交换柱3月13日4碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—分离纯化（硫铵沉淀）3月20日5碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—分离纯化3月27日6碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—纯化参数测定4月3日7清明节放假4月10日8碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定—电泳时间安排1.缓冲液ApH8.51000mL/组 50mmol/LTris-HCl 0.2mmol/LNaCl 0.5mmol/LEDTA2.缓冲液BpH8.5500mL/组 50mmol/LTris-HCl 2mmol/LMgAc2 1mmol/LEDTA3.缓冲液C缓冲液A+50%甘油1000mL4.测活液：50mMTris-HClpH8.5 200mL0.2mg/mLBSA10mmol/LpNPP2mmol/LMgAc2试剂5.终止液：0.5mol/LNa3PO41000mL/组6.0.5mol/LNaOH500mL

7.标准蛋白质溶液（1mg/mLBSA）：10mgBSA用缓冲液

A溶解，10mL容量瓶定容。8.酶稀释液100mL50mmol/LTris-HClpH8.5，0.2mg/mLBSA9.考马斯亮蓝试剂2000mL:考马斯亮蓝G250200mg溶于100mL95%乙醇中，加入200mL磷酸，用蒸馏水稀释至2000mL，滤纸过滤（最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G250，7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸）。或考马斯亮蓝G250200mg溶于100mL95%乙醇中，加入200mL磷酸混匀，配成原液。临用前取原液15mL加蒸馏水稀释至100mL，滤纸过滤。10.1mol/LTris-HCl（pH7.4）100mL 12.1gTris溶于80mL超纯水，待Tris完全溶解温度降低至室温，用浓HCl调节pH至7.4（约7mL浓HCl），定容到100mL，高压灭菌，4℃保存试剂11.LB培养基100mL胰蛋白胨1.0g；酵母提取物0.5g；NaCl1.0g加入200μL5mol/LNaOH调节pH至7.0~7.4，加入去离子水至总体积100mL，121℃高压灭菌20分钟12.TM表达培养基100mL（200mL）胰蛋白胨1.2g；酵母提取物2.4g；NaCl1.0g；50%甘油1.2mL加入1mol/LTris0.93mL调pH至7.4，加入去离子水至总体积100mL，121℃高压灭菌20分钟13.50mg/mL羧苄青霉素（Carb） 用灭菌水配制，无菌滤器过滤，-20℃冰箱保存14.200mg/mLIPTG 取2gIPTG溶于8mL去离子水，用水补至10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，保存于-20℃冰箱15.0.3mol/LNaCl200mL/组试剂把TM培养基每组配量改为200mL,与后面幻灯介绍一致。碱性磷酸酶基因表达预培养：接一单菌落到3mL含Amp的LB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜；取2mL菌液转移到200mL含Amp的TM液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养3小时，至OD6000.7-0.8，加入IPTG（40ug/mL）；250C、160rpm继续振荡培养16小时；离心6000rpm，40C，10min，菌体沉淀在-200C冻存。Sephacryl-S200HR分子筛层析柱的准备装柱：Sephacryl-S200HR介质悬液100mL连续装入1.0×60cm的层析柱中。先用10mL0.5mol/LNaOH流洗柱子，再用200mL缓冲液A平衡好柱子备用，流速为15mL/h。阴离子交换DEAE-FF柱的准备装柱：DEAE-FF介质20mL连续装入1.6×20cm的层析柱。先用50mL0.5mol/LNaOH洗涤柱子，再用200mLBufferB平衡好柱子备用（流速：1mL/min）表达菌体细胞的破碎加入30mLBufferB，重悬菌体超声破碎：输出功率1200W，超声2秒，间隔10秒，超声40次12,000rpm4℃离心20min取上清200uL加入200uL甘油，混匀（Ⅰ号样品），-20℃保存备用上样：将离心上清以0.5mL/min的流速连续地加入已平衡好的DEAE-FF层析柱中，每管接收3mL

洗涤：用40mL

BufferB洗涤杂蛋白（流速：1mL/min），每管收3mL

洗脱：用200mL

BufferB其中含0－0.3mol/L的连续NaCl梯度洗脱AKP（流速：1mL/min），每管接收3mL，收集有活性的AKP，取200uL加入200uL

甘油，混匀（Ⅱ号样品），-20℃保存备用。DEAE-FF离子交换层析每100mL的AKP溶液中缓慢加入60克固体硫酸铵，溶解后静置10分钟，10000rpm离心10分钟，沉淀用尽量少(0.5mL左右)BufferA溶解，10000rpm离心10分钟，取50uL离心上清加入50uL甘油，混匀，-20℃保存备用(III号样品)。硫酸铵沉淀SephacylS-200HR分子筛层析将上述离心上清上样、洗脱（BufferA），洗脱流速为15mL/小时，每管接收2mL。合并光吸收高峰管，并用BufferC对其透析浓缩4小时，分装-20℃保存备用(IV号样品)。分子筛层析柱再生：用10mL0.5MNaOH洗涤柱子，再用50mL20％乙醇洗涤，4℃保存。阴离子交换DEAE-FF柱：待样品洗净后，先用20mL0.5mol/LNaOH流洗柱子，再用200mL蒸馏水洗至中性，最后用100mL20％的乙醇洗涤后，于4℃冰箱保存。1.酶活力的测定AKP能水解底物分子上的磷酸基团从而使底物分子脱磷酸化，含磷化合物对硝基酚磷酸（pNPP）能被AKP水解为对硝基酚（pNP）和游离的磷酸基团；pNPP在碱性条件下为无色化合物而pNP则为黄色化合物，在410nm处有光吸收值，可通过测定反应中释放的对硝基酚的量来表示AKP的活力。比活性是指单位重量蛋白质样品中所含的酶活性单位，随着酶被逐步纯化，其比活性也随之逐步升高，所以测定酶的比活性可以鉴定酶的纯化程度。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示，即比活力=活力单位/mg蛋白。酶活性单位（U）定义为：在300C、pH8.5、以pNPP为底物的条件下，每分钟产生1纳摩尔对硝基酚所需要的酶量定为一个酶活性单位（pNP的摩尔消光系数为：17500L·mol-1·cm-1）。各级分酶活力与蛋白质含量测定

按下表测定各级分AKP的酶活性，使各级分的A410测定值控制在0.2-0.6之间。管号测活液（uL）酶稀释液（uL）AKP（uL）300C反应10min终止液（mL）13604003.623600403.633600403.6以1号试管为空白对照，在410nm处比色级份稀释倍数A410A410平均值活力U／mLⅠⅡⅢⅣ各级分酶活力与蛋白质含量测定考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量是利用蛋白质与染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合朗博比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处的光吸值与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。2.蛋白质含量的测定1)标准曲线的制作各级分酶活力与蛋白质含量测定分两组取不同体积的标准蛋白溶液（1mg/mL牛血清白蛋白）按下表进行平行操作，标准蛋白溶液与考马斯亮蓝G250显色后在595nm处测定每管的吸光度。管号1234567标准蛋白的量ug0102030405060标准蛋白溶液uL0102030405060H2OuL100908070605040考马斯亮兰G-2505mL摇匀，1h内以1号试管为空白对照，在595nm处比色A5950A5950平均值绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白的量为横坐标绘制标准曲线，并计算出曲线的斜率。各级分酶活力与蛋白质含量测定测定方法同上，取合适体积的各级分样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内（各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数）。根据所测定的A595nm值和标准曲线的斜率计算出各级分样品的蛋白质含量(mg/mL)。级分ⅠⅡⅢⅣ稀释倍数A595A595平均值蛋白含量mg/mL2)各级分蛋白质含量的测定各级分酶活力与蛋白质含量测定根据测得的结果，计算出各级分的数据并填如下表，并分析各步纯化的可行性与纯化效果。级分体积mL蛋白mg/mL总蛋白mg活力U/mL总活力U比活力U/mg提纯倍数回收率蛋白活力Ⅰ1100%100%ⅡⅢⅣ

3)分离纯化参数的分析各级分酶活力与蛋白质含量测定将上述不同样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），对所提取的碱性磷酸酶样品进行蛋白质含量和纯度的检测，并且将电泳检测结果进行拍照保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AKP30%胶贮液200mL：丙烯酰胺58.4g和亚甲基双丙烯酰胺1.6g加双蒸水溶解定容至200mL，棕色瓶存于4℃。分离胶缓冲液100mL：1.5mol/LTris-HCLpH8.8浓缩胶缓冲液50mL：0.5mol/LTris-HCLpH6.8SDS电泳缓冲液600mL/组：25mmol/LTris，0.192mol/LGly，0.1%(W/V)SDS