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文档简介
组织对氧磷酶1(PON1)有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途1(PON1)1水解有机磷酸,释放出对硝基苯产物,出现吸光峰值的变化,即采用光度法来测定组织样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体组织裂解悬液样1的有机磷酸酶活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。技术背景对氧磷酶parapxonasePONEC3.1.8.)是一种水解酯类ester、有机磷酸酯organophosphat)和内酯(lactone)的多态性酶,分成三个亚型:PON1PON2PON370%,在氨基酸层面上达65%PON1,为钙离子依赖性和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein;HDL)相关性糖蛋白,含有354氨基酸,43Kd分子量,分布在肝脏、肾脏、小肠和血清(50毫克/升)中。具有有机磷酸organophosphtas(phosphotriesteras(arylesteras(thiolactonase)与HDLLDL和HDL上的氧化性磷酯,以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等,例如杀虫剂对硫磷(parathion)降解产物对氧磷paraoxon、毒死蜱(chlorpyriphos、神经毒(sarin(soman(homocysteineDH、-丁内酯(-butyrolactone)等,延缓和抑制低密度脂蛋白lowdensitylipoproteinLD)氧化作用,阻止脂质过氧化物产生,保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤,达到抗粥样硬化(antiatherogenic、解PON1活性降低与慢性肾衰、糖尿病、外周神经病变、家属性高胆固醇血症、心血管疾病、肝纤维化等有关。PON244Kd分子量,分布在脑、肝脏、肺、肾脏、睾丸等大多数组织中,但血清PON2具有水解芳香酯和内酯酶的功能,但不能水解有机磷酸。具有细胞内抗氧化作用,预防粥样硬化等功能。PON340Kd分子量,主要分布在肝脏中,少量在肾脏中。主要水解各种内酯和环状羧酸酯,具有抗氧化功能。基于人工合成底物对硝基苯磷酸二乙酯(diethyl-p-nitrophenylphosphat,在对氧磷酶1的作用下,水解产生对硝基苯(p-nitrophenol)和磷酸二乙酯(diethylphosphate),通过对硝基苯产物吸收峰值的变化(405nm波长),来定量分析对氧磷酶1的有机磷酸酶活性。其反应系统为:产品内容清理液(Reagent毫升裂解液(ReagentB) 毫升缓冲液(ReagentC) 毫升底物液(ReagentD) 毫升阴性液(ReagentE) 毫升产品说明书 1份保存方式保存底物液(ReagentD)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;底物液(ReagentD)具有毒性,注意操作安全;有效保证6月用户自备1.5毫升离心管:用于样品CAOZUO1的容器15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器(微型)台式离心机:用于样品制备96分光光度仪或酶标仪:用于光度分析实验步骤一、样品准备500毫克组织重量(选择步骤)15毫升锥形离心管(选择步骤)xx毫升清理液(Reagent1次移入到一个液氮冻存管即刻放进液氮罐过夜次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:)15毫升锥形离心管xx微升裂解液(ReagentB)1.5毫升离心管30秒,充分混匀30分钟,期间每1030秒(如需暂时停止,放进70)4516000g(13000RPMeppendorf5415)5001.5毫升离心管10微升进行蛋白定量检测(建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)即刻放进-70开启并设定好分光光度仪(37℃405n16次(5分钟,并置零从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化缓冲液(ReagentC)xx微升缓冲液(ReagentC)到新的比色皿xx微升底物液(ReagentD)上下倾倒数次,混匀373分钟xx微升阴性液(ReagentE)上下倾倒数次,混匀(3秒之内)即刻放进分光光度仪检测,此为样品背景对照(5分钟读数-0分钟读数xx微升缓冲液(ReagentC)到新的比色皿xx微升底物液(ReagentD)上下倾倒数次,混匀373分钟50微升待测样品(100微克蛋白)上下倾倒数次,混匀(3秒之内)即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(5分钟读数-0分钟读数五、计算样品活性六、酶标仪测定96孔板上做好相应标记:背景对照和待测样品xx微升缓冲液(ReagentC)96孔板里xx微升底物液(ReagentD)到所有孔里96孔板373分钟xx阴性液(ReagentE)或待测样品(20微克蛋白)到相应孔里96孔板即刻放进酶标仪检测:05分钟读数注意事项20次(比色皿)80次(96孔板)操作操作时,须戴手套底物液(ReagentD)具有毒性,注意操作安全1次3秒内光度测定5分钟光度测定后,比色皿须清洗彻底50分钟读数表明具有酶活性建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升(本公司提供 Bradford
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