第二章工业发酵菌种选育

第二章工业发酵菌种来源及选育一、微生物工业对菌种的要求微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野生型，有的是通过诱变得到的突变体。

发展趋势：从野生型变异株自然选育代谢控制育种诱变育种基因工程定向育种第一节工业发酵生产菌种（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：

二、工业发酵微生物及其代谢产物什么是初级代谢？什么是次级代谢？P12什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？

初级代谢产物是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物(如氨基酸、核酸)相对产生的次级代谢产物。1、微生物代谢产物的类型

2、微生物次级代谢与初级代谢的关系许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支中间体。微生物次级代谢，其目的产物的生物合成途径取决于微生物的培养条件和菌种的特异性。什么叫分叉中间体？问题次生代谢产物主要在哪个时期合成？次生代谢产物生成与初生代谢产物有关吗？三、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌

1、常用的细菌

大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶、蛋白酶等2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母

应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪面包酵母啤酒酵母红酵母3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：酱油、酱类（淀粉酶）米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲应用：生产甲义丁二酸

毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶4、放线菌气生菌丝孢子丝孢子基内菌丝培养基种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素第二节、生产菌种的选育

二、菌种选育方法诱变育种代谢调控育种自然选育基因定向育种：基因工程，杂交，细胞工程(原生质体融合）一、选育的目的

改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。采样预处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏

(P14)如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：三、自然选育的基本过程

（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。2、根据微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境取样如产纤维素酶菌、产壳聚糖酶菌、产蛋白酶菌或脂肪酶菌、产淀粉酶菌或糖化酶菌、极端微生物等。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-25cm处的土约10-25g，盛入无菌的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。（二）富集培养富集培养：人为地增加分离概率，增加该菌种的数量，使目的微生物在种群中占优势。方法：控制一定的养分（碳源或氮源）；控制一定的培养条件（温度、pH、底物等）。（三）培养分离

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法、组织分离法。培养条件控制营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、控制培养温度、控制通气量1、如何控制营养成分，分离自养型微生物、固氮菌、纤维素酶菌、几丁质酶菌？2、如何控制培养基pH分离产柠檬酸的黑曲霉？3、分离放线菌、细菌、霉菌时，选择哪些抑制剂？4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么？厌氧培养中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么？5、如何分离芽孢菌？问题？实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80℃处理30分钟文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓（四）筛选（生产能力的考察）

初筛：平板筛选法和摇瓶发酵筛选法。复筛：采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验

自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。（六）微生物选择性分离的原理和方法施加选择性压力分离法1、控制营养和培养条件以利于待分离菌株的生长和抑制非目的微生物的生长；2、根据目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择性培养基，通过观察微生物在选择培养基上生长状况或生化反应进行分离。（3）抗生素或试剂；（P32）施加选择性压力分离法；（1）环境条件：温度、pH、渗透压、氧气等；（2）碳源、氮源（培养基）；（P32）（4）培养方法：分批式富集培养（摇瓶培养），恒化式富集培养（连续培养）（P34）酪素培养基和淀粉培养基变色圈法：如果胶酶产生菌、谷氨酸生产菌等；透明圈法：如淀粉酶生产菌、纤维素酶生产菌等；生长圈法：工具菌是营养缺陷型菌株。抑菌圈法：工具菌一般是抗生素敏感菌。拮抗菌对青枯病菌的抑制拮抗菌对白绢小菌核菌的抑制随机分离法(生物活性物质产生菌的分离）P19-21抗生素产生菌的分离高灵敏度的试验菌抗肿瘤药物产生菌的分离生化诱导分析法和SOS生色检测法酶抑制剂产生菌的分离选择与生理性或病理性相关酶抗病毒药物产生菌的分离生长因子产生菌的分离营养缺陷型菌株为试验菌免疫激活剂产生菌的分离抑制细胞表面酶多糖产生菌的分离菌落较黏稠2.工业菌种育种的手段：自然选育（P36）诱变育种（P37~41）杂交育种（P43~48）原生质体融合（P48）基因工程育种（P58）

四、诱变育种诱变育种的概念以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种包括诱变和筛选两个部分。诱变成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择。

1、诱变剂和诱变处理

物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；

紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

选用最适剂量，充分利用复合处理的协同效应。MutationViachemicalorphysical,andbiologicalmeans2、诱变剂的选择1）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4）紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。3、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选出发菌株→纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理→平板分离→筛选→保藏/扩大试验

（活菌计数）

（计数）4、例子

紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为250-240nm．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

操作步骤

1）将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

2）将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。3）取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。

5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。

6．取中间培养液稀释分离、培养。

7．挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌N—甲基—N‘-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。操作步骤

1．单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。

2．MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。3．诱变处理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃3天后计数。

4．死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。

5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．五、代谢控制育种改变代谢通路育种改变自我代谢调节系统育种六、基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。基因重组１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。五、防止菌株衰退的措施菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低1、衰退的可能原因（1）、菌种保藏不妥（2）、菌种的生长要求没得到满足2、防止菌种衰退的方法

A、从菌种选育方面考虑B、尽量减少传代次数（减小突变）C、创造良好的培养条件D、利用不易衰退的细胞传代E、采用有效的菌种保藏方法第三节、微生物菌种保藏◆目的把微生物菌种资源在一定条件下保存，使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌株原有培养特性和生理活性。1、菌种保藏的目的及意义◆意义菌种是国家的一种重要资源，保持优良菌种的优良性能，可保证高产稳产；在基础研究中，菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性；◆原理根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼状态（休眠状态）。2、菌种保藏基本原理及策略◆策略:保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是有针对性的创造干燥、低温和隔绝空气、缺营养或添加保护剂的环境条件，使微生物细胞代谢处于低水平或几乎停止。3、保藏机构

国际重要菌种保藏机构缩写名称ATCC美国标准菌种保藏所，马里兰州，罗克维尔市CBS真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市NCTC国立标准菌种保藏所，英国，伦敦CCGMC中科院微生物所普通微生物菌种保藏管理中心CCTCC武汉大学中国典型培养物保藏中心ARS美国农业部农业研究服务部3、保藏机构中国一般保藏机构l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AL－IV）：病毒。2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；中国农业科学院土壤肥料研究所，3）工业微生物菌种保臧管理中心（CICC）；轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。4）医学微生物菌种保臧管理中心（CMCC）；中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）∶真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；农业部兽医药品监察所，北京。斜面传代法穿刺法液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

4、保藏方法暂时保藏法长期保藏法（定期移植低温）把菌种接种到所需要的斜面培养基上，最适温度下培养，长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于4℃的冰箱或冷库中保藏。然后每隔一定时间重新移接一次，传代保藏。移种时间因菌种不同而异，几周到几个月不等。◆斜面传代保藏法优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌1938年发明。基本方法和原理：是在斜面培养或穿刺培养上加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥，隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。此法适用于各类微生物，尤其是不形成芽孢或孢子的真菌，保藏期限2-10年。操作方法：矿油灭菌；菌种培养；灌注矿物油；低温（4℃左右）保藏

◆矿油（液体石蜡）保藏法◆砂管保藏法适用菌种：产孢子的微生物，如放线菌、芽孢细菌和某些真菌等，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。首先把加一定保护剂的菌悬液冷冻，然后在冷冻状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久的休眠状态，从而达到长久保藏的状态。◆冷冻真空干燥保藏法特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。

适用菌种：对于不长孢子或很少长孢子的真菌保藏效果不佳。安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉