第四章 抗体制药

第四章抗体制药第一节概述

1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。

1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。

抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。

免疫球蛋白是化学结构上的概念，抗体是生物学功能上的概念，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性抗体产生的机制：

抗原物质机体免疫系统B淋巴细胞浆细胞球蛋白刺激激活分化、增殖分泌20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。

多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。

单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。

单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。McAb的改造1.改造的必要性①单克隆抗体均是鼠源性抗体，直接应用于人体易产生人抗鼠免疫反应②完整抗体分子的相对分子量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度2.改造方向①降低单克隆抗体的免疫原性②降低单克隆抗体的相对分子量

第二节单克隆抗体

单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。

一、抗原与动物免疫

制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。

为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。

免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法：

体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。7可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。

脾内免疫法即在麻醉下直接将

0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。

体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。

体外免疫法：用4～8周龄BALB/c

小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5%CO2，37℃下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。o

二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的方法：脾细胞（1×108）骨髓瘤细胞（2×107）混合聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。

用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。

PEG相对分子量4000，浓度为50%

二甲基亚砜增加融合率。

细胞融合后可产生多种融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。选择性培养:

培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻断DNA合成。

三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。

克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。ELISA用于破伤风抗体的筛选四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定

杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。单抗进行Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定五、单克隆抗体的大量制备

体外培养法可获的10μg/ml抗体体内诱生法可获的5～20mg/ml抗体

用BALB/c小鼠降植烷接种杂交瘤细胞取腹水离心上清。六、单克隆抗体的纯化

依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1离心取上清，超滤，盐析。2分离⑴凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析IgG单抗纯化。第三节

基因工程抗体及其制备

杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相对分子量。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。Ig分子结构Ig分子的基因结构二、抗体的结构及基因组成（一）抗体的结构（图4-4）抗体分子的结构是由二硫键连接起来的约4条多肽链

N-端区段

2条H链：约450~570个aa组成C-端区段

N-端区段

2条L链：约214个aa组成

C-端区段

Ig分子aa组成和排列顺序多变，称为可变区（V区）aa组成和排列比较恒定，称为恒定区（C区）

1.在V区，某些特定位置的aa残基显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区（CDR），抗体能与特定抗原特异性结合与CDR密切相关）

2.C区决定抗体分子的异种抗原性（二）抗体结构与性质的关系一、人鼠嵌合抗体

抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。二、改形抗体（CDR移植抗体）

Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。三、小分子抗体

1.结构特征：基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的到2.类型：①Fab片段抗体：由完整的轻链和重链的可变区加部分恒定区

②FV抗体：由重链和轻链的可变区组成

③单链抗体：由VH链和VL链的CDR通过一段连接肽连接而成的重组蛋白④单域抗体：由H链或L链的单个CDR区组成；分子量只有原抗体，表面疏水性强，与抗原的非特异性结合能力较强⑤最小识别单位（MRU）：由互补决定区构成；也具有与抗原结合的能力，但亲和力极低

1.单链抗体的优点①可以去除许多造成非特异反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显像的背景更清晰②更容易渗透到肿瘤组织中去，增加有效药物浓度③相对分子量小，所以鼠源性抗体的免疫原性小，能消除人抗鼠的排斥反应，延长其在人体内的半衰期

2.单链抗体在大肠杆菌中表达①非融合表达：以游离的形式直接在细胞质中表达②融合表达：与菌体蛋白融合表达（N-端为E.Coli菌体蛋白，C-端为抗体蛋白）③分泌表达：与信号肽基因相连接，产物分泌到胞外；具有功能的单链抗体单链抗体的优点与表达形式第四节多功能抗体及其制备

双功能抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年提出。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

双功能抗体（研制阶段）双功能抗体（研制阶段）1.概念：又称为双特异性抗体（BsAb），是由人工构建的，具有同时与两种抗原特异结合的双臂抗体2.双功能抗体的优点：一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；另一个臂可识别免疫效应细胞及分子，如CD3、毒素、药物等，介导T淋巴细胞、LAK细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。双功能抗体在治疗肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病中将会产生巨大的应用价值。（1）化学交联法：将两个抗体交联在一起，此法快速、简便、高效，纯化简单；但此法构建的双功能抗体，可能由于化学交联过程会影响抗体的功能，不太容易达到靶部位，体内稳定性较差，且无连续性等

3.构建方法（2）生物学方法（杂种-杂交瘤法）：将普通抗体产生细胞（脾细胞）与产生McAb的杂交瘤细胞融合而成；此法连续性好，但构建过程复杂、周期长、纯化技术复杂，基因组过大且不稳定，又不能对双功能抗体进行改造。故不常用

（3）基因工程法：1993年由Holligen等人首次构建而成，即用人工接头连接不同抗体的VH和VL，以融合蛋白的形式表达非共价键二聚体VHA-肽-VLBVLA-肽-VHB共价连接双特异性单链抗体VHA-肽-VLA-连接肽-VLB-肽-VHB应用亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋等蛋白质结构域将两单链抗体连接起来。VHA-肽-VLA-Leu拉链（铰链区）-VLB-肽-VHB4.制备BisFvs的方法核心是将两条SCFV以一定方式连接起来，并使其各自保留与特异性抗原结合的能力。亮氨酸拉链实质上是一段长约35个氨基酸的寡肽，其中每7个氨基酸出现一个亮氨酸残基，共有5个亮氨酸残基。利用亮氨酸拉链介导SCFV或Fab片段在细胞内二聚化连接2种分子可以制备基因工程同质双价或异质双特异性Bs(sFv)2和(Fab)2小抗体。亮氨酸拉链作为一种具有特殊作用的短肽，是双特异性抗体制备最简单的模型系统

将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。将双链抗体的一条臂针对抗原，另一臂针对免疫球蛋白，这种双链抗体可与免疫球蛋白结合，恢复抗体的全部功能，包括结合补体、诱导单核细胞内的呼吸爆发和吞噬功能、增强T细胞杀伤细胞的协同作用等。

5.在治疗中的应用

利用其能与2个抗原结合的能力，设计出更高效的免疫阻断抗体、免疫组化抗体等。Kontermannn等设计的双特异抗体，一条臂可与抗原蛋清溶菌酶(HEL)、癌胚抗原(CEA)、HIV一1GP120结合，另一条臂为抗大肠杆菌半乳糖苷酶。以该双链抗体作为酶结合物，用ELISA法检测HEL，免疫组化法检测CEA，免疫印迹法检测GP120，加人特异抗体后，再加人B半乳糖苷酶，洗涤后加人底物显色，结果表明，这些方法可检出相应的抗原，证明双特异抗体可用于酶免疫分析。6.在免疫诊断中的应用Atwell等制备的双特异抗体，一条臂抗红细胞表面血型糖蛋白的，另一条臂抗神经氨酸酶，中间用一段5个氨基酸(Gly4Set)的接头连接。这段接头的作用是阻止VH、VL结合于一个分子，并稳定二聚体的形态。该抗体可与上述抗原结合，以此建立快速的全血凝集试验。

多功能抗体--单链抗体多聚体（SCFV多聚体）

在SCFV的基础上发展了结合性能良好的SCFV多聚体，包括二聚体、三聚体和四聚体等，这些多价、多效能、高亲和力的新型小分子抗体较单链抗体具有诸多优势。其显著优点是它的高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影象分析及治疗。有应用价值的SCFV多聚体应具有以下特征：1）能高选择、高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合2）在血液循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力3）应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使重复给药不受限制4）分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保持适当的滞留时间抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性,称之为抗体融合蛋白。抗体融合蛋白

①配基-配基型融合蛋白②配基-Ig型嵌合蛋白1.常见类型③配基-FV嵌合蛋白

④受体–FV型融合蛋白

⑤酶-抗体型融合蛋白（抗体酶）2.构建抗体融合蛋白的原则将前一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。在抗体的N端和C端融合其它蛋白都可以获得成功。关键是两个蛋白间的接头序列linker，一般说来3~5个氨基酸就可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的长链，可缓解两种蛋白的相互干扰。基因工程抗体与IL-2的融合蛋白在肿瘤治疗中可特异性将IL-2的作用集中在肿瘤局部，以减少对周身的副作用。抗体融合蛋白能特异定位于肿瘤局部，输送高浓度的IL-2，从而充分发挥细胞因子激活的效应细胞杀伤肿瘤细胞的作用。酶-抗体型融合蛋白-抗体酶或催化性抗体（AbzymeorCatalyticantibody）抗体酶的制备方法1）使用与过度态结构相似的半抗原通过杂交瘤方法生产；2）对抗体分子进行化学修饰，使抗体分子与催化基因相连；3）通过过度态类似分子对抗体库进行筛选获得符合要求的抗体酶。抗体酶在药学方面的应用主要表现在：1）抗体酶前体药物疗法，即利用抗体酶将靶部位的前体转化成有效的药物，这样可以提高该处的药物浓度，避免药物对正常组织的伤害；2）在药物合成中实现普通有机化学反应以及催化反应难以实现的药物合成反应，尤其在抗生素和天然药物的合成方面应用较多；3）抗体酶还可以用于选择性地水解病毒蛋白的肽键，从而阻止病毒与靶细胞结合，或是选择性地水解癌细胞膜上的蛋白质，从而有效地破坏癌细胞膜，达到治疗癌症的目的。（1）其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗（ADEPT）。（2）抗体酶在药物治疗中的应用前景被医学界普遍看好，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。3.抗体融合蛋白的应用

前体药物：该药物需在体内经特定酶催化后才显示活性的药物。

当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，其优点是提高肿瘤区域的药物浓度，降低对正常细胞的毒性。该方法可使药物浓度在肿瘤部位提高10倍，而在正常组织中降低2—3倍。免疫融合蛋白基因表达可用真核细胞，也可用原核细胞表达（分泌/包含体表达）。基因工程抗体与IL-2的融合蛋白能特异定位于肿瘤局部，减少对周身的不良反应。CTLA4-Ig的应用：T细胞活化需要两个信号，只接受第一个信号时，并不产生活化，而是进入无反应状态，甚至导致程序性死亡，许多分子参与第二信号的传递，其中B7和CD28/CTLA4被认为是最重要的共刺激分子。CTLA4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）位于T细胞表面，为B7受体，与B7的亲和力是CD28的20倍。CD28与CTLA4的功能有着明显的差别：在有第一信号存在的情况下，B7与CD28结合后，共刺激信号传递给T细胞，产生正常的免疫应答；而B7与CTLA4结合后，则对T细胞的免疫应答起负性调节作用。CTLA4-Ig是由人CTLA4分子的胞外区，与人的IgG1的恒定区CH2和CH3区融合而成的可溶性嵌合蛋白，可与人/大鼠/小鼠的B7分子结合。CTLA4-Ig是一种高效/无毒并兼有免疫抑制和诱导免疫耐受的生物免疫抑制剂，对移植排斥的防治和一些自身免疫疾病的治疗具有广阔的应用前景。第五节抗体工程

抗体研究的沿革①多克隆抗体

1890年~1975年，是用抗原免疫动物，获得多克隆抗体②单克隆抗体

1975年~20C90Y，以杂交瘤技术制备单克隆抗体③以基因工程方法制备抗体基因工程技术制备；以1994年Winter创建噬菌体抗体库技术为代表基因工程抗体不用人工免疫动物和杂交瘤技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动、植物大规模生产抗体，并在此基础上发展成抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法

1.获取目的基因

提取mRNA，经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段（如VH和VL），抗体基因的组合形式多为单链抗体，2.抗体库技术的载体

目前应用最多的是噬菌粒（质粒-噬菌体），它具有噬菌体和质粒的共同特点；转化效率高，抗体基因文库容量大

3.淘筛

抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增4.表达与鉴定

目的克隆经过鉴定后，导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用westernblot分析确定后，就完成了全过程

二、噬菌体抗体库的分类（一）按抗体基因的性质分1.DNA文库2.cDNA文库（二）按抗体基因的来源分1．天然抗体库(nativeantibodylibrary)2．免疫抗体库3．半合成抗体库4．全合成抗体库三、噬菌体抗体库技术的特点

1.模拟天然全套抗体库

抗体文库可以达到1011库容，可包含B细胞的全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA，抗体的VH和VL基因进行随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然全套抗体库2.避开了人工免疫和杂交瘤技术由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以“挑出”任意的抗体基因，因而免除了人工免疫和细胞融合3.可获得高亲和力的人源化抗体

在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲合力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此所产生的抗体必然都是高亲合力的人源化抗体四、基因工程抗体的表达

1.原核生物融合表达和分泌表达

2.真核生物如酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞等，都是分泌表达

3.转基因植物烟草叶中的表达（植物抗体）

4.转基因动物单基因水平，还处于研发阶段五、噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，六、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达：融合表达，分泌表达。2、真核细胞表达：酵母，昆虫细胞，CHO，真菌等3、转基因植物表达：烟草，拟南芥4、转基因动物表达：转基因鼠可不经过免疫，利用抗原从库中直接筛选出特异性抗体，获得抗体的时间短，可大量生产，特别是能直接获得人源化抗体。用SCID小鼠制备人单抗SCID小鼠移植入人淋巴细胞（人鼠嵌合模型）抗原免疫杂交瘤技术基因工程人单抗人抗体鼠—将小鼠Ig基因灭活，然后转入人Ig基因，生产出人单抗遗传工程鼠基因工程抗体真核细胞高效表达流程图第六节抗体诊断试剂

抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定，成为血清学鉴定。主要有三大类抗体诊断用药（习惯上将体外试验用的称为试剂，体内导向诊断用的称为药物）

概况免疫学的迅速发展使诊断技术不断更新，抗体用于诊断，体现在三类诊断药物中：①血清学诊断中使用的抗体制剂(体外诊断)②免疫标记用的抗体制剂(体外诊断)③体内导向诊断的抗体药物(体内诊断)一、血清学鉴定用的抗体类试剂

血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应

此类诊断血清是临床病原菌诊断的有力工具，是诊断试剂中重要的一类试剂。若用单克隆抗体还可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确

（1）常用诊断血清的品种和用途（表4-6）

如：血液分型血清——血型检测沙门氏菌诊断血清——肠道病原菌（如伤寒、副伤寒杆菌）志贺氏菌诊断血清——细菌性痢疾病原菌大肠杆菌诊断血清——大肠杆菌（2）诊断血清的制备制备细菌抗原免疫动物制备抗体血清（3）诊断血清诊断方法直接凝集反应：向细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体后，在有适量电解质存在下，能形成肉眼可见的凝块（常用玻片法做定性试验）

1.鉴定病原菌的抗体试剂2.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂

（1）检测方法：早期检测HBsAg曾用双向琼脂扩散法和对流电泳法；但由于敏感度不高而被卫生部禁用。现在运用反向被动血凝试验（RPHA）进行检测（2）检测原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中有乙型肝炎病毒表面抗原时，则发生特异性结合反应而使血细胞发生凝集（3）方法特点：用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原，其灵敏度高、操作简单、快速、价廉、不需特殊设备，已被广泛用于乙肝病例检测（4）制剂方法：先用HBsAg免疫豚鼠，获得抗-HBsAg血清，经（NH4）2S04盐析及DEAE-Sephadex柱层析，取其IgG,再将新鲜O型红细胞用丙酮和甲醛处理，然后用纯化的抗-HBsAg血清于pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞，洗去多余的蛋白质成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成3.妊娠诊断试剂

妊娠后，血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素（HCG）含量增高，在三个月内达到高峰。测定方法有生物试验法、胶乳间接凝集试验法、酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法

胶乳间接凝集法：胶乳中加入HCG致敏（试剂为胶乳和抗-HCG血清）

胶乳直接凝集法：胶乳中加入HCG抗体致敏（试剂只用胶乳）血型有多个系统，其中最重要的是ABO血型系统，按人红细胞表面带有的A或B种凝集原来分型。4.抗ABO血型系统血清ABO血型抗血清的制备①人源性ABO血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置4℃过夜，使非特异性抗体吸附在血块上一起除掉；然后分离血清，加入叠氮钠防腐，56℃30min灭能，使补体等活性丧失；在抗A血清中加入美蓝，在抗B血清中加入复红，以资区别，分装保存②动物源性ABO血型抗血清是用人血型物质A和B免疫马得到的抗体血清，然后用O型红细胞吸附去掉非特异性抗体，再加防腐剂，除菌过滤，分装③单克隆抗体是应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A或抗B血清（但由于单克隆抗体特异性极高，而血型物质较复杂，易得到假阴性结果）二、免疫标记技术用的抗体类试剂

对于常规方法不能观察的Ag-Ab反应，可用放射性核素、荧光素或酶对抗体标记的方法，将Ag-Ab反应放大，提高反应的敏感性，可对微量抗原物质进行定性或定量检测。（一）荧光抗体诊断试剂

用荧光色素标记抗体，当抗原与抗体反应时可发出荧光。可用于定性或定量（二）放射免疫用抗体诊断试剂

用放射性核素（如125I）标记抗体，制备成抗体诊断试剂。此法具有放射性核素分析的高度灵敏性和抗原抗体反应的特异性两大特点

（一）荧光抗体诊断试剂免疫荧光技术：用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、罗丹明(Rhodamine)或藻红素等荧光色素标记抗体，直接向组织切片或细胞悬液滴染，在荧光显微镜下或用流式分光光度计（流式细胞仪）观察。荧光抗体的制备

免疫荧光测定方法（1）直接法：采用荧光抗体直接与抗原反应。优点：特异性高；缺点：每种抗原须单独制备相应的荧光抗体。（2）简接法：用荧光标记抗球蛋白抗体（荧光第二抗体）来检测未知抗原。只需制备一种荧光标记的抗体，即可用以检测多种抗原抗体系统，敏感度比直接法高5～10倍。免疫荧光（神经元）免疫荧光显像系统（二）免疫酶抗体诊断试剂用酶标记来检测抗原，分为免疫酶染色（组比法）和酶免疫测定两种类型。免疫酶染色法用酶标记抗体，称为酶标抗体。测定时酶标抗体与抗原发生特异性结合，发生组化反应，产生有色物质，可在光学显微镜下直接观察。常用辣根过氧化物酶(horseradishpeiroxidase，HRP)标记抗体，加入酶底物－二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)。如果抗体与抗原结合，底物将被分解，呈现棕褐色。酶免疫测定（ELA）是一种在液相内微量待检抗原物质的定量测定方法。酶联免疫吸附技术：ELISA

酶免疫测定在方法上的一个重大改进，使抗原或抗体吸附在聚苯乙烯塑料等表面上进行反应，大大简化了抗原抗体结合物的分离过程。用途广泛，敏感度高，既可定性也可定量。酶联免疫吸附试验――ELISA酶联免疫反应示意酶标仪间接法：用于检测血清中抗体载体抗原＋抗体（待检血清）＋酶标抗抗体＋底物-→显色反应夹心法：检测标本中抗原载体抗体＋抗原（待检标本）＋酶标抗体（特异性）＋底物-→显色反应ELASA（竞争法）生物素-抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物可作为一种指示剂，组成一个新的生物放大系统。该法特异性强、结合稳定，在与抗体、酶、荧光素等结合后不影响后者的生物活性，可用于检测多种抗原抗体系统。灵敏度：扩散试验<电泳试验<凝集试验<ELISA<BAS-ELISA、放射免疫分析试验。生物素-酶标抗生素蛋白系统抗体诊断试剂（BAS-ELISA）（三）放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术：灵敏度最高的检测手段。诊断试剂设计中考虑的是用放射性同位素131I和125I标记抗体，放射自显影检测。把同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来。在医学实践中可用放射性自显影法检测微量抗原物质。放射免疫（竞争法）结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）三、导向诊断药物在体内直接诊断病原的抗体试剂被称为导向诊断药物。放射免疫显像定位技术是把特异性与病原细胞表面抗原结合的抗体预先同重金属络合剂—二乙基三胺五乙酸(DTPA)耦联成Ab-DTPA，注入体内，“自动寻的”与病原细胞结合；再注入In-113M（放射性核素，铟），使其与DTPA络合。放射免疫显像定位技术通过放射自显影，可以对病原细胞(如肿瘤)进行组织定位、显示肿瘤细胞转移形成的病灶、观察抗体在血液中的功能半衰期、确定肌体对抗体做出的不良反应等。导向诊断药物的显像肿瘤标记物放射免疫显像

白细胞分化抗原是不同谱系白细胞分化、成熟的不同阶段表达的细胞表面抗原分子，亦即白细胞表面标记。它们参与机体重要的生理和病理过程。例如：（1）免疫应答过程中免疫细胞的相互识别，免疫细胞抗原识别、活化、增殖和分化，免疫效应功能的发挥；（2）造血细胞的分化和造血过程的调控；（3）炎症发生；（4）细胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。

四、CD单克隆抗体系列

应用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群，简称CD（clusterofdifferentiation)，按照发现的顺序，白细胞分化抗原的命名从CD1、CD3，已达到CD247。用异硫氰酸荧光黄或罗丹明标记这些分子，在免疫学上认识淋巴T细胞的功能、分化、信息传递等具有十分重要的意义。四、CD单克隆抗体系列CD4细胞第七节抗体治疗药物

以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有近20年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原，但治疗用的制剂还没有一种达到商品化的程度主要障碍：

①抗体相对分子量大，穿透力低，不能达到靶部位或靶位摄取量低②鼠源性McAb的排异反应抗体药物研究概况一、放射性核素标记的抗体治疗药物

抗体作为放射性核素的导向载体，应用比较成功优点：操作简单、用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学，放射性标记的抗体有较大的杀伤范围，有利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用，