第三章基因工程常用的克隆载体

第三章基因工程常用的克隆载体载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第一节质粒载体一、质粒的定义存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主复制的遗传成分（复制子）复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位染色体DNA质粒DNA噬菌体DNA质粒DNA编码的表型抗性特性抗生素抗性：重金属抗性：毒性阴离子：其他：AmprCmlrKanrStrrTetrHg、Ni、Co、Pd、Zn砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体代谢特性：修饰寄主生活方式：植物冠瘿病、发根病冠瘿碱代谢二、质粒DNA分子的特性结构特性SC型共价闭合环形DNA（cccDNA，covalentlyclosedcircularDNA）OC型开环DNA（ocDNA，opencircularDNA）

L型线性DNA（L-DNA，lineDNA）染料结合特性：

呈平面结构的染料（EB）可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比L-DNA少，因此密度较大。提取纯化质粒DNA：氯化铯-溴乙锭密度梯度离心法（CsCl-EtBr）质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、存在溴乙锭污染！变性特性cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条件即可复性。提取纯化质粒DNA：微量碱变性法裂解菌体细胞加碱调pH至12～12.5DNA变性离心加NaAc调pH至去除蛋白质、RNA质粒DNA纯度较低、周期较短！复制特性拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分子的数目严紧型复制：1-2个松弛型复制：10-100个制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制剂，增加质粒拷贝数！三、质粒载体应具备的条件具有复制起始位点具有至少两种易被检测的选择性标记具有多克隆位点（MCS）

多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一识别序列所组成的DNA序列具有尽可能小的相对分子质量易于分离纯化目的DNA装载能力强拷贝数高多重酶识别位点几率低应属于松弛型复制应为非传递型四、几种常用的质粒载体pBR322来源：大肠杆菌Ori：标记基因：apr、tcr分子大小：4363bp拷贝数：50-100/cellpBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpUC18来源：大肠杆菌Ori：标记基因：apr、lacZ’MCS：分子大小：2686bp拷贝数：1000-2000/cell第二节λ噬菌体载体λ噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增λDNA缺失达总量20%的DNA时，仍不影响其特性，可为外源基因提供装载空间一、基本概念噬菌体感染周期：吸附注入复制包装裂解整合温和噬菌体烈性噬菌体原噬菌体营养体溶源菌溶菌途径溶源途径二、λ噬菌体的形态结构及繁殖特性形态结构头部：正二十面体、直径约55nmλDNA：线性、约48kb尾部：长约150nm、粗12nm繁殖特性λ噬菌体溶源菌裂解侵染浑浊噬菌斑三、λDNA的结构及功能5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因(cΙ、cⅡ)早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAANRJ左臂区：A→J中间区：J→N右臂区：N→RcΙ基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活cΙ基因表达：溶源途径cΙ基因不表达：溶菌途径形成浑浊噬菌斑形成噬菌斑四、λ噬菌体载体的构建消除多余的限制性内切酶位点点突变基因组置换、缺失增加单一酶切位点去除非必要区段λ噬菌体头部蛋白可包装DNA大小：75～105%λDNA长度（38～52kb）增加筛选标记基因五、λ噬菌体载体的主要类型插入型载体：

λDNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源DNA插入的酶切位点特点：承载能力较小（<10kb）筛选标记：基因插入失活免疫功能失活的插入型载体β-半乳糖苷酶基因失活的插入型载体表达阻遏蛋白免疫功能失活的插入型载体CΙ基因体外包装插入片段CΙ基因不表达阻遏蛋白β-半乳糖苷酶失活的插入型载体表达酶LacZ基因无色混浊噬菌斑插入片段LacZ基因不表达酶蓝色混浊噬菌斑替换型载体：又称取代型载体。在λDNA可替换片断两端具有两个限制酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNA片断取代特点：承载能力大筛