博导论坛-样品预处理技术的研究进展

梅素容华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所环境与健康教育部重点实验室复杂样品预处理技术的研究进展个人简介1991.9-1995.7四川大学环境系环境监测专业本科1995.9-1998.7武汉大学化学系分析化学专业硕士1998.9-2001.7武汉大学化学系分析化学专业博士2001.8-2003.9华中科技大学环境学院工作2003.9-2005.10华中科技大学公共卫生学院博士后2005.11-至今华中科技大学公共卫生学院工作2008.12-2009.5德国慕尼黑大学临床化学研究所访问学者2010.4-2010.11韩国昌原国立大学化学系访问学者背景为了探讨环境因素对健康的影响，需要从个体暴露、个体效应和人群效应等多个角度，深入分析环境与健康之间的关系。（队列研究）个体暴露主要检测复杂的环境和食品样品中低浓度污染物。个体效应主要检测外来污染物进入人体后在体内的分布和代谢水平。人群效应主要检测大量人群样本中相应的生物标记物和代谢标记物，可以准确评价个体暴露、群体暴露、个体和群体效应，因此特别适合环境污染物对人体健康危害的综合评价。

样品前处理技术简介固相萃取技术固相微萃取技术液相微萃取超临界流体萃取微波萃取加速溶剂萃取本课题组相关的代表性研究工作提纲复杂样品前处理在样品分析中的地位样品前处理的目的样品前处理的评价准则经典的样品前处理技术样品前处理技术简介复杂样品前处理在样品分析中的地位样品分析流程：采样（6.0％）样品前处理（61.0％）分析测试（6.0％）数据处理及整理报告（27.0％）样品前处理的目的提高测试精度提高方法的选择性使样品易保存和运输延长测试仪器的使用寿命。。。。。。检测痕量组分复杂的体系样品预处理新技术与方法的探索与研究已成为当代分析化学以及相关交叉学科的重要课题与发展方向之一。不能检测浓缩痕量的被测组分将待测组分与母体或基体分离衍生化主要的作用是富集和净化样品前处理的评价准则是否能最大限度地除去影响测定的干扰物；被测组分的回收率是否高；操作是否简便、省时；成本是否低廉；对人体及环境是否产生影响。经典的样品前处理技术液－液萃取蒸馏索氏萃取沉淀离心大量使用有机溶剂处理时间长操作步骤多较大误差影响操作人员健康污染周围环境基本原理：与液相色谱（HPLC）分离过程相仿，是一种吸附萃取，主要适用于液体样品的处理。当试样通过装有合适的固定相时，被测组分由于与固定相作用力较强被吸附留在柱上，并因吸附作用力的不同而彼此分离，样品基质及其他成分与固定相作用力较弱而随水流出萃取柱。分类：反相SPE、正相SPE和离子交换SPE与HPLC不同之处有：

1.填料粒径（>40m)要比HPLC填料（3－10m

）大；

2.柱效低，通常只有10－50塔板。固相萃取（solid-phaseextraction,SPE）SPE的优点(1)简单、快速和简化了样品预处理操作步骤,缩短了预处理时间。(2)处理过的样品易于贮藏、运输,便于实验室间进行质控。(3)可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂处理各种不同类的有机污染物。(4)不出现乳化现象,提高了分离效率。(5)仅用少量的有机溶剂,降低了成本。(6)易于与其他仪器联用,实现自动化在线分析。SPE装置SPE的基本步骤举例：反相萃取柱C18,C8,Phenyl,CN,NH2活化：甲醇、乙腈等，1倍柱管体积或3倍柱床体积3-5mL/min平衡：水，1倍柱管体积或3倍柱床体积,3-5mL/min上样：水溶液（缓冲剂稀释）生物流体等,1mL/min淋洗：含5-50%极性有机溶剂的缓冲水溶液，1-2倍柱管体积或5-10倍柱床体积，1-2mL/min洗脱：极性或非极性有机溶剂，可选加水、缓冲剂、酸、碱等调节剂；2-4倍柱床体积。上样：流出与吸附剂作用最弱的杂质；极性最强淋洗：流出与吸附剂作用比目标物弱的杂质；极性比目标物强淋脱：流出目标物活化：洗脱与吸附剂作用比目标物强的杂质；极性比目标物弱SPE的研究进展之一：新型吸附剂

常规的SPE吸附剂类型共同的缺点：选择性差SPE的研究进展之一：新型吸附剂抗体键合吸附剂

充分利用了生物免疫抗原－抗体之间的高灵敏度和高选择性，尤其适应于水中痕量有机物的富集与分离，将抗体键合到反相吸附剂的硅胶表面或聚合物表面，就制得了抗体键合吸附剂。研制开发能专门检测各种优先污染物的单克隆或多克隆抗体已成为SPE技术的前沿研究领域（如多环芳烃、多氯联苯、有机氯农药、有机磷农药、以及一些环境激素类物质的单克隆抗体等。

缺点：生物活性物质易失活，缺乏保存和操作的不稳定性，并且在制备和纯化方面条件苛刻，成本较高，操作繁琐，费时费力，SPE的研究进展之一：新型吸附剂

人工抗体吸附剂（分子印记聚合物，MIPs）

基本原理：以目标分子（待测物）为印记分子，将结构互补的功能化聚合物单体分子通过共价键或非共价键的方式与印记分子结合形成某种可逆的复合物，加入交联剂将这种复合物“冻结”起来，制得高聚物，然后将印记分子提取出后所形成的对印记分子具有“预定”选择性的分子识别位的大分子聚合物即为MIPs，又被称为“人工抗体”，

特点：特异性可以和生物抗体相媲美，同时具有一定的机械和化学强度，对酸、碱、有机溶剂、温度和压力均有一定的耐受性，比生物抗体易于合成和保存。目前MISPE用于复杂样品预处理和浓缩富集是十分有效的。

分子印迹聚合物（MIPs）的制备过程分子印迹技术（molecularimprintedtechnology,MIT）分子识别设想首次合成发展酶/底物抗原/抗体激素/受体Pauling

抗原为模板合成抗体，1940Wulff,MIP,1972Mosbach,Nature

,1993SPE的研究进展之二：萃取方式固相膜萃取

将SPE吸附剂附载于微孔滤膜可以制成萃取膜，常用于处理大体积水样。膜片0.45微米的孔径对过滤悬浮颗粒或微生物也有很好的效果，是EPA推荐的样品预处理技术之一（EPA525），并已开始在国内应用。SPE的研究进展之二：萃取方式固相微萃取（solidphasemicroextraction,SPME）

SPME是在SPE技术的基础上发展起来的一项新的样品预处理技术。它用一个类似气相色谱微量进样器的萃取装置在样品中萃取出待测物后直接与GC或HPLC联用，在进样口将萃取的组分解吸后进行色谱分离与分析检测。该法从完成萃取到分析的整个过程只需十几分钟，主要用于挥发性或半挥发性有机污染物的净化、富集。基质固相分散技术（Matrixsolid-phase

dispersion,MSPD）

1989年,美国Barker首次提出可同时分散与萃取固体、半固体样品的MSPD技术。该方法将涂渍有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料与样品一起研磨所得到的半干状态的混合物作为填料装柱,然后采用类似SPE的方法,用不同的淋洗剂洗脱出各种待测物。与SPE比较,

优点:浓缩了传统样品前处理过程中的样品均匀化、组织细胞裂解、提取和净化等过程,从而减少了组织匀浆、沉淀、离心、pH调节和样品转移等操作步骤，避免了样品的损失。适用于各种固体、半固体样品中农药多残留分析的提取净化。

SPE的研究进展之二：萃取方式QuEChERS(Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe)方法

QuEChERS方法由Anastassiades和Lehotay等于2003年提出的一种基于固相萃取和基质固相分散技术的样品预处理方法，具有快速(quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)和安全(safe)等特点。

步骤：首先用乙腈作为提取溶剂，振荡提取，同时加入氯化钠和无水硫酸镁通过液液分配除水，然后取部分萃取液经无水硫酸镁和PSA(N-丙基乙二胺填料)分散固相萃取净化后,用色谱等进行分析。SPE的研究进展之二：萃取方式搅拌棒吸附萃取(stirbarsorptiveextraction,SBSE)

SBSE技术由Sandra等在1999年首先提出并由GerstelGmbH商品化，是一种新型的无溶剂或少溶剂，集萃取、净化、富集为一体的样品前处理技术。萃取时，搅拌棒在完成搅拌的同时吸附目标物，可消除搅拌磁子的吸附竞争，同时使用非常简便。SPE的研究进展之二：萃取方式(a)浸入式和(b)顶空式萃取方式(a)整体材料为涂层的SBSE示意图、(b)不同尺寸的SBSEM的照片和(c)SBSEM的截面图磁性固相萃取(magnetic

solid-phaseextraction,MSPE)

MSPE是一种以磁性或可磁化的材料作为吸附剂基质的一种固相萃取技术，在MSPE过程中，磁性吸附剂不需要填充到吸附柱中，而是被添加到样品的溶液或者悬浮液中，将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，在外部磁场作用下就可使目标分析物与样品基质分离开来。优点：1、萃取过程简单化，不需要昂贵的设备；2、化学物质的使用量大为减少，没有二次污染产生；3、可以萃取溶液或悬浮液中的目标分析物，且由于样品中的杂质一般都是反磁性物质，能有效地避免杂质的干扰。SPE的研究进展之二：萃取方式SPE的在线联用技术越来越受到人们的重视，逐渐成为快速、灵敏、可靠的分析方法之一。在线操作时，SPE柱富集的全部待分析物直接进入仪器，使萃取效率大大提高，减少了操作者与有毒试剂接触的机会，且缩短了分析时间。在线分析的重现性、准确性都有较大改善，回收率也有较大提高，还能改善检测限，并适用于野外的实时自动化连续检测。SPE的研究进展之三：在线联用技术SPE的应用用SPE净化和富集的EPA方法FoodChemistry93(2005)349–353MISPENISPEC18不同的固相萃取后HPLC检测干辣椒酱中的苏丹红ⅠMISPE的应用实例：干辣椒酱中苏丹红Ⅰ的检测固相微萃取（solidphasemicroextraction,SPME）基本原理：利用待测物在基体和萃取相间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，达到待测组分进行提取和富集的目的。于1989年由加拿大Waterloo大学的J.Pawliszyn教授等首次提出。1993年美国的Supelco公司推出了商品化的SPME设备。SPME操作简单、携带方便、操作费用低廉，另外克服了SPE吸附剂孔道易堵塞的缺点。SPME的装置及萃取过程SPME的装置及萃取过程SPME方法分为萃取过程和解吸过程：1.萃取过程。将萃取器针头插入样品瓶内，压下活塞，使具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取，经一段时间后，拉起活塞，使萃取纤维缩回到起保护作用的不锈钢针头中，然后拔出针头完成萃取过程。2.解吸过程。热解析：在GC分析中采用热解吸法来解吸萃取物质。将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，压下活塞，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后续的气相色谱分析。溶剂解吸：利用HPLC专用的SPME解吸接口解吸或将萃取纤维插入一定的解吸溶剂中进行解吸，进入后续的HPLC分析。SPME的应用:

多环芳烃及邻苯二甲酸酯SPME的应用：PBDEsZhangW,WuCY,XingJ,etal.AnalChem,2009,81:2912图

水样中7种PBDEs的HSSPME-GC-ECD色谱图1—BDE-35；2—BDE-47；3—BDE-77；4—BDE-100；5—BDE-99；6—BDE-154；7—BDE-153SPME-GC/MS分析尿样的色谱图a－疑似药物滥用者的尿样；b－加标的空白尿样（加标浓度为50ng/mL）。1－苯丙胺（AMP）；2－甲基苯丙胺（MAP）；3－3，4-亚甲二氧基苯丙胺（MDA）；4－3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）；5－亚甲基-二氧乙基苯丙胺（MDEA）SPME的应用：毒品及滥用药物分析ChiaK,HuangS.Anal.Chim.Acta,2005,539:49-54液相微萃取技术(liquid-phasemicroextrac

tion,LPME)是1996年由Cantwell等提出的一种新型样品前处理技术,其基本原理是目标分析物在样品与微升级的萃取溶剂之间达到分配平衡,从而实现溶质的微萃取。LPME克服了传统液液萃取技术繁琐、浪费、污染等缺点,具有消耗溶剂少(仅需µL

级),富集倍数大,萃取效率高,操作更简便,便于实现分析的自动化等优点。主要萃取方式:单滴液相微萃取(single-dropliquid-phasemicroextraction,SDME),中空纤维保护膜微萃取(hollowfiber-basedliquid-phasemicroextrac

tion,HF-LPME),分散液液微萃取(dispersiveliquid-liquidmicroextraction,DLLME)等。液相微萃取（liquidphasemicroextraction,LPME）单滴液相微萃取（SDME）单滴液相微萃取（SDME）指萃取溶剂形成单滴，悬挂于微型注射器的针尖来进行萃取。萃取剂体积一般为几微升，相比于传统的LLE降低了萃取相/水相的比例，从而提高了富集效率。两种模式：直接浸入萃取（DI-SDME)和顶空萃取（HS-SDME)。DI-SDME指萃取溶剂直接浸入样品溶液中进行萃取，稳定性较差，会随着搅拌的进行而损失或脱落，多适于基质较简单的样品。HS-SDME将萃取液滴悬挂于样品溶液上方的顶空部分，适合于复杂样品中挥发性、半挥发性分析物的萃取。稳定性较好，降低了样品中非挥发性基质的干扰，使萃取所得目标物较干净，是目前主要模式。直接浸入萃取法

顶空萃取法中空纤维膜微萃取(HF-LPME)HF-LPME核心为“有机膜”，利用有机溶剂渗透到多孔中空纤维膜壁，形成有机溶剂膜为中间相或与膜内溶剂一起形成接收相。增加了萃取相与样品溶液的接触面积，中空纤维膜的使用能够排除大分子物质的干扰，并增加了萃取相的稳定性，准确度和灵敏度也有所提高。两种模式：两相和三相。两相HF-LPME是将一定长度多孔聚丙烯中空纤维膜超声清洗晾干后，浸入有机溶液中，使纤维壁形成有机溶剂膜。然后用微量注射器注入一定体积有机溶剂至纤维膜腔内。随后，将上述中空纤维置入样品溶液或者样品顶空进行萃取，萃取后接收相多用GC分析。三相HF-LPME利用中空纤维有机膜为中间转移相，第三相则通过微型注射器注入膜内，一般为水相，适合于HPLC、CE分析。三相HF-LPME常用于分析离子分析物。两相三相分散液液微萃取(DLLME)2006年由Assadi等提出DLLME技术。首先在已加入一定体积样品溶液的离心管中迅速注入分散剂和萃取剂的混合溶液。在分散剂的帮助下，萃取剂极易分散到样品溶液中形成无数微小液滴，从而使体系形成水/分散剂/萃取剂的乳浊液。通过超声、溶剂搅拌等方法让萃取剂与样品溶液充分接触，促使目标分析物从水相转移至萃取相，快速达到平衡，获得良好的富集效果。经离心后，萃取相沉积于管底，用微量注射器采集进行分析测试。萃取剂多为密度比水大的有机溶剂，如氯苯、四氯化碳等。萃取剂的用量一般在几微升到数十微升，通常为整个萃取体系总体积的1％～3％。分散剂则选用易溶于水的极性溶剂，如丙酮、甲醇、乙腈等。应用实例DLLME用于环境水样中痕量有机磷农药的萃取超临界流体萃取(Supercriticalfluidextraction,SFE)基本原理：SFE也是在两相之间进行的一种萃取方法，所不同的是萃取剂是利用超临界流体SCF（Supercriticalfluid,即其温度和压力略超过或靠近临界温度Tc和临界压力Pc，介于气体和液体之间的流体），从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和提纯的目的。SCF的密度较大，与液体相仿，所以它与溶质分子的作用力很强，像大多数液体一样，很容易溶解其他物质;同时它的粘度较小，接近于气体，传质速度很高；加之表面张力小，很容易渗透到固体颗粒，并保持较大的速度，可以使萃取过程在高效、快速的条件下完成，是一种十分理想的萃取剂。最常用的超临界流体是CO2,可用于萃取非极性和中等极性的物质。现在也对其它气体进行了研究,如N2O、C2H6、C3H8NH3、CHF3

等。不同物态时CO2的性质SFE的应用根据超临界流体的性质可知，它特别适合于处理烃类及非极性脂溶化合物，如醚、酯、酮及其它分子量达300至400道尔顿的化合物，在低于300bar的压力下，很容易将它们从样品基体中萃取出来，但如果样品分子中含羟基或羧基等极性基团，就会使萃取较为困难。对于糖类、糖苷、氨基酸、卵磷脂类极性物质，以及蛋白质、核酸、纤维素、多萜类等天然大分子与合成的极性高分子，SFE至今还不是一种最佳的选择。SFE在处理环境样品中的典型应用微波辅助萃取（Microwaveaidedextraction,MAE）MAE是利用微波加热来加速溶剂对固体样品中目标物质的萃取过程。它具有设备简单、高效、快速、试剂用量少，可同时处理多个样品等优点。微波萃取主要适合于固体或半固体样品，样品制备整个过程包括粉碎、与溶剂混合、微波辐射、分离萃取液等步骤。所需的主要设备是（1）带有控温附件的微波制样设备；（2）微波萃取用制样杯，一般为聚四氟乙烯材料制成的样品杯。萃取步骤：准确称取一定量已粉碎的待测样品置于微波制样杯内，根据萃取物情况加一定量的适宜萃取溶剂（不超过50ml）。将装有样品的制样杯放到密封罐中，然后把密封罐放到微波制样炉里。设置目标温度和萃取时间，加热萃取。加速溶剂萃取（Acceleratedsolventextraction,ASE）ASE是通过改变萃取条件，以提高萃取效率和加快萃取速度的新型高效的萃取方法。通常是在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法。其突出的优点是有机溶剂用量少、快速、回收率高。该法目前已被美国EPA选定为推荐的标准方法。ASE可以代替传统的溶剂萃取和液