免疫学诊断技术

医疗器械根底知识及免疫学诊断技术

济南卓冠生物技术第一页，共54页。目录医疗器械根底知识体外诊断试剂分类胶体金技术简介酶联免疫检测技术简介第二页，共54页。一医疗器械根底知识1、?医疗器械监视管理条例?于1999年12月28日国务院第24次常务会议通过，2000年4月1日起施行。2、医疗器械：医疗器械是指单独或者组适宜用于人体的仪器、设备、器具、材料或者其他物品，包括所需要的软件；其用于人体体表及体内的作用不是用药理学、免疫学或者新陈代谢的搜段获得，但是可能有这些手段参与并起一定的辅助作用；其使用旨在到达以下预期目的：〔1〕对疾病的预防、诊断、治疗、监护、缓解；〔2〕对损伤或者残疾的诊断、治疗、监护、缓解、补偿；〔3〕对解剖或者生理过程的研究、替代、调节；〔4〕妊娠控制。第三页，共54页。医疗器械按照其医疗器械分类断定的根据〔一〕医疗器械根据其构造特征分为：有源器械和无源器械。〔二〕根据不同的预期目的，可将医疗器械归入一定的使用形式。无源器械的使用形式有：医用敷料；外科器械；重复使用外科器械；一次性无菌器械；植入器械；护理器械、体外诊断试剂、其他无源接触或无源辅助器械等。有源器械的使用形式有：诊断监护器械；输送体液器械；实验室仪器设备、医疗消毒设备；其他有源器械或有源辅助器械等。第四页，共54页。

〔三〕根据使用中对人体产生损伤的可能性、对医疗效果的影响，医疗器械使用状况可分为接触或进入人体器械和非接触人体器械。第五页，共54页。

根据医疗器械的危险性：第一类是指，通过常规管理足以保证其平安性、有效性的医疗器械；第二类是指，对其平安性、有效性应当加以控制的医疗器械；第三类是指，用于支持、维持生命；对人体具有潜在危险，对其平安性、有效性必须严格控制的医疗器械。第六页，共54页。1.2医疗器械消费企业应当符合以下条件：

具有与其消费的医疗器械相适应的专业技术人员；具有与其消费的医疗器械相适应的消费场地及环境；具有与其消费的医疗器械相适应的消费设备；具有对其消费的医疗器械产品进展质量检验的机构或者人员及检验设备。第七页，共54页。1.3医疗器械经营企业应当符合以下条件具有与其经营的医疗器械相适应的经营场地及环境；具有与其经营的医疗器械相适应的质量检验人员；具有与其经营的医疗器械产品相适应的技术培训、维修等售后效劳才能。第八页，共54页。

二体外诊断试剂

2.1定义体外诊断〔IVD，InVitroDiagnosis〕试剂，包括可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、安康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，在人体之外通过对人体的样本〔如血液、体液、组织等〕进展检测而获取临床诊断信息的产品和效劳，包括仪器、试剂、校准品、质控品等。原理是通过试剂和体内物质在体外的反响强度或速度来判断体内物质的性质和数量，通过和标准品的比较来判断人体的生理状态。第九页，共54页。1.临床生化试剂：用化学方法使样本产生变化，通过测吸光度，波长及颜色反响等进展疾病的诊断、治疗和监控；2.免疫诊断试剂：免疫生物学开展很快，利用抗原和抗体的特异性反响的原理进展疾病的诊断；2.2体外诊断试剂的分类第十页，共54页。3.分子诊断试剂：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的构造或表达程度的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。4.功能检测试剂：如血凝试剂，看凝血状态是否正常。5.其他：细胞染色切片，镜像等第十一页，共54页。2.3免疫学诊断试剂的类型1.按方法分为间接免疫学试剂和直接免疫学试剂〔如双抗体夹心法，双抗原夹心法，间接法，竞争法等〕；2.按示踪剂分为放射免疫法，酶联免疫法，荧光法，化学发光法，胶体金法，乳胶法等；第十二页，共54页。

免疫层析胶体金技术是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式,该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相,通过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动,并同时使样品中经标记物标记的待测物与包被在层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生高特异、高亲和性的免疫。三胶体金技术简介第十三页，共54页。1胶体金标记技术的相关定义1.1定义免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。胶体金标记胶体金标记，本质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒外表的包被过程。吸附机理一般认为是胶体金颗粒外表负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成结实结合。第十四页，共54页。胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等〔葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白〕等非共价结合，形成胶体金标记物。第十五页，共54页。

1.2透射电镜下观察金颗粒的形状劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大第十六页，共54页。2胶体金的制备量取200ml超纯水，加热至沸腾，并保持微沸。参加15ml1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟。参加1%的氯金酸5ml,继续煮沸，待颜色有变化后计时，煮沸10min。停顿搅拌，冷却至室温。第十七页，共54页。胶体金粒径的大小与复原剂的量有关系粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同。1％柠檬酸三钠ml0.300.450.70

金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红红橙红橙

吸收峰(nm)220240535525522518

径粒(nm)14797.571.54024.515第十八页，共54页。

〔1〕玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否那么影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。〔2〕试剂配制必须保持严格的纯洁，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜〔〕过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。〔3〕配制胶体金溶液的pH以中性〔〕较好。〔4〕氯金酸的质量要求上乘，杂质少。第十九页，共54页。

4胶体金技术的种类及特点4.1快速免疫金渗滤法主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。第二十页，共54页。斑点金免疫渗滤第二十一页，共54页。

4.2免疫层析法

以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体渐渐向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色〔红色〕反响，检测抗原/抗体。第二十二页，共54页。衬板样品垫金标垫吸收垫膜胶体金免疫层析试纸条的构成第二十三页，共54页。

双抗体夹心法标本Goldtestcontrol第二十四页，共54页。竞争法标本标准抗原Goldtestcontrol第二十五页，共54页。

其检测原理与上述的其它方法有所不同：胶体金颗粒标记单克隆抗体，而检测线包被小分子抗原，质控线包被抗鼠IgG。检测时，样本中的待检抗原首先与金标抗体结合，上行到达检测带时，如待检抗原把一定量的抗体完全饱和，那么金标抗体将不能与检测带的抗原结合，不会出现肉眼可见的红色条带，为阳性结果。如标本中无待检抗原，那么金标抗体与检测带的抗原结合，形成红色条带，为阴性结果。选用该方法应特别注意胶体金颗粒的抗体吸附量及包被抗原量。第二十六页，共54页。间接法第二十七页，共54页。测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即汲取液体向上端挪动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。双抗体夹心法为例第二十八页，共54页。假设标本中有待测特异抗原，即可与免疫金复合物中的抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获，在膜上显出红色反响线条〔T〕。

第二十九页，共54页。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合〔免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG〕，而显出红色质控线条〔R〕。

第三十页，共54页。阴性标本那么无反响线条，而仅显示质控线条。

第三十一页，共54页。4.2.1结果断定图示——卡型第三十二页，共54页。4.2.2结果断定图示——条型第三十三页，共54页。4.2.3结果断定说明阳性结果：出现质控线和反响线两条紫红色线，实验结果为阳性。阴性结果：仅出现一条紫红色质控线，实验结果为阴性。无效：不出现质控线红线或仅出现一条反响线红线，实验结果为无效结果，应重试。竞争法的结果断定那么相反第三十四页，共54页。5免疫胶体金技术的特点简捷快速：操作简单，一般只要5-10min就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要时间更长。结果易于断定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。第三十五页，共54页。6

胶体金技术的应用第三十六页，共54页。

7相关仪器

喷膜仪仪器参数

仪器尺寸为：430mmx410mmX360mm

平台大小:450mmX70mm

平台挪动速度:0-330mm/sec

X、Y、Z轴挪动误差:<50um

定位精度:±10umin1axis;±25umin2axis

喷点方式

BJQ3000:非接触喷点

AJQ3000:非接触喷点

划线宽度

BJQ3000:0.50mm/line〔喷点0.20mm/drop〕

AJQ3000:0.5-5mm

最小喷量

BJQ3000:10nl/drop

AJQ3000:1ul/cm

划线精细度

BJQ3000:±1%

AJQ3000:±2%第三十七页，共54页。切条机仪器参数:进料宽度：≤100mm进料长度：不限,可连续进料切割切割宽度：≥1mm,宽度连续可调切割宽度设定位数：0.01mm切割精度：±0.1mm切割速度：230次/分钟,速度连续可调切条计数：单次工作和总工作分别计数刀片:日本进口,耐磨高碳钢材料抗静电装置：建议选配电源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)×330(W)×260(H)mm第三十八页，共54页。它采用抗原与抗体的特异反响将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反响，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体〔免疫吸附剂〕②酶标记的抗原或抗体〔标记物〕③酶作用的底物〔显色剂〕四酶联免疫检测〔ELISA)技术简介1.ELISA的原理第三十九页，共54页。

测量时，抗原〔抗体〕先结合在固相载体上，但仍保存其免疫活性，然后加一种抗体〔抗原〕与酶结合成的偶联物〔标记物〕，此偶联物仍保存其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原〔抗体〕反响结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化复原反响而呈颜色。第四十页，共54页。

其所生成的颜色深浅与欲测的抗原〔抗体〕含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计〔酶标仪〕加以测定。其方法简单，特异性强。第四十一页，共54页。2

ELISA的类型2.1双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进展包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。第四十二页，共54页。2.2双抗体夹心法测抗原反响原理和形式与双抗原夹心法类似。用特异性抗体进展包被和制备酶结合物，以检测相应的抗原。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗体代替酶标抗抗体。第四十三页，共54页。2.3间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体〔二抗〕以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。。第四十四页，共54页。2.4竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进展测定，可以采用竞争法形式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。第四十五页，共54页。2.5捕获法测IgM抗体第四十六页，共54页。

3ELISA的试剂制备及操作以双抗体夹心法为例第四十七页，共54页。获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质参加封闭蛋白溶液以封闭载体外表残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本〔抗原〕形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物加底物进展酶催化反响根据颜色反响的程度进展该抗原的定性或定量测定第四十八页，共54页。4.1特异性

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学构造和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特