GFP绿色荧光蛋白的应用前景

GFP绿色荧光蛋白的应用前景1、荧光蛋白的发现及其作用机理2、GFP在生物领域的最新应用进展3、GFP在动物营养相关领域的研究和应用GFP应用具体应用作为转基因植物和动物的筛选标记用于定位标记跟踪观察微生物发育机理研究用于细胞筛选用于免疫学2、GFP在生物领域的最新应用进展2.1显像技术2.2示踪技术2.4生物光学感受器2.5筛选技术2.3报告基因2.6抗体生产2.1显像技术由于荧光蛋白有多种颜色，且稳定、无毒，所以荧光蛋白可使得动物体内复杂的系统结构可视化。Livet等用多种不同颜色的荧光蛋白对神经系统进行了基因标记，使得我们能够观察到大脑的集成线路图，可以直观地看到神经细胞以及细胞间的相互作用。图6中五彩缤纷的色彩形象地展现了复杂的神经网络。另外，荧光蛋白还可用于生物发育领域，能够形象的观察生物体的器官组织结构的变化，随着发育学研究的深入，荧光蛋白必将成为强有力的工具。Wan等发现用GFP标记斑马鱼的胰脏，可以清楚地观察到胰脏外分泌部位的发育（图７）。2.2示踪技术一般的荧光染料标记的微生物，由于其生长快、分裂多，染料可在短时间内被稀释，所以不能实时准确地观察微生物侵入活体动物以及细胞的过程。近年发现，荧光蛋白可用于示踪流行性病毒对活体细胞的感染，流行性病毒可被实时监控，借助于这一新技术，我们可以更深入地研究其感染方式。Zhao等发现用GFP标记细菌，可以详细地对细菌的入侵进行时空检测，以确定细菌特异性的感染部位以及传染源的空间位移。GFP克服了一般荧光染料所带有的缺陷，GFP必将会进一步地取代一般的荧光染料，有效地帮助学术研究者观察分析细菌、病毒的感染方式。2.3报告基因由于荧光蛋白发光团的形成不具物种专一性，可发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光，所以转入宿主细胞后的荧光蛋白基因很稳定，对多数宿主的生理无影响，是理想的报告基因。荧光蛋白作为报告基因，可显示生物体１个或多个基因的表达的状况，并可对活体细胞内的蛋白质运动和细胞元件间的互作进行实时荧光显像，且直观、准确。Gregor等构建了bicoid（一种成形素）与GFP的融合蛋白，通过直接光漂白和间接对bicoid扩散常数的估测，使研究者能直接地观察到bicoid输送的实时影像，帮助研究者更好地了解bicoid成形素梯度的稳定性和核动态。2.4生物光学感受器荧光蛋白由于其独特的光信号转导机制，适于用作活细胞内的光学感受器。现在许多研究者将具有信号转导功能的分子识别位点结合到荧光蛋白分子上来设计成生物感受器。经研究发现，利用GFP感受器可以检测多种分子（如核酸、激素）的表达状况，甚至可以检测活体细胞中蛋白质的构象变化，其潜在应用前景极为广阔。Taniguchi等构建了一种黄色荧光蛋白融合库（YFPfusionlibrary）作为单分子感受器，可以有效用于分析大肠杆菌单细胞中蛋白质和mRNA表达水平的关系。2.5筛选技术利用GFP可显色的特点，我们还可对需要的物质进行筛选和纯化。比如增强型GFP（enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP）融合蛋白可被荧光激活细胞分选术（FACS）有效地筛选，生产出稳定的人类糖皮质激素受体配体结合域（humanglucocorticoidreceporligand-bindingdomain，hGRLBD）。不仅如此，GFP还可用于检验玉米胚乳和胚芽提取物的筛选和纯化重组蛋白的效力。GFP筛选技术已在生命科学的多个领域得到了广泛应用和认可。2.6抗体生产由于新型病毒的鉴别特征有限，使得传统的抗体生产方法不能被有效运用，生产抗体便遇到了极大的困难，而GFP的发现及其在分子生物学中的应用解决了这一难题。Steela等将新型的病毒—葫芦黄发育迟缓症病毒（cucurbityellowstuntingdisordervirus，YSDV）外壳蛋白植入GFP基因，并转入农杆菌，再将农杆菌接入本生烟用于生产该病毒，然后再用GFP纯化的重组蛋白－CYSDV便可制备多克隆免疫抗体。快速灵活的GFP抗体生产技术在应对新型流行性病毒、及时控制疫情等方面必定会发挥巨大的作用。3、GFP在动物营养相关领域的研究和应用2.1显像技术2.2示踪技术2.4生物光学感受器2.5筛选技术2.3报告基因2.6抗体生产3.1益生菌在动物胃肠道中的动态检测GFP在生物学方面的技术开发和应用推广，必然推动动物营养学研究的发展。现在GFP已经应用于饲用益生菌的动态监测，并且表现出了良好的研究和应用前景。利用GFP示踪技术，可以直观地观察到GFP重组菌在肠道黏膜中的定植、在局部区域的繁殖以及扩散到整个肠道的过程，使整个动态过程可视化，这对研究益生菌的益生机制提供了有力的技术。这些研究成果为深入地探索微生态制剂的作用机制提供了依据，同时进一步证实了GFP作为新的基因报告在微生物动态检测方面有着广泛的应用前景。3.2营养物质在胃肠道内的动态观察边慧慧等首次采用带有GFP质粒的大肠杆菌作为蛋白质指示剂，简单、直观、形象地指示了鱼类摄食饲料后不同时间食糜蛋白质在消化道内的分布状况。同时，利用GFP还可以通过测定黏膜上皮细胞、组织的荧光强度初步估计蛋白质的消化吸收情况。采用GFP观测营养物质在胃肠道内的流通与变化，使得抽象的营养消化与吸收变得清晰、具体。3.3饲料原料的改良由于GFP荧光的产生无需辅助因子和底物，可在活细胞或组织中进行荧光检测，不会对植物的生长发育产生毒害，所以GFP已经在转基因植物中已经成为了一个非常有效的报告基因。提高饲用植物中的含硫氨基酸水平是动物营养研究者们关注的一个焦点，因为含硫氨基酸对奶制品、羊毛产量及肉类都有重要的影响，关宁等将玉米醇溶蛋白（γ-zein，有含硫氨基酸的蛋白质）基因和玉米醇溶蛋白和菜豆球蛋白的融合基因（ｚ-eoli）分别与植物表达载体pCABIA1302的GFP报告基因融合，通过遗传转化研究了γ-zein和ｚ-eoli基因在洋葱表皮细胞和烟草中的表达情况，并验证所构建植物表达载体的正确性，为研究三叶草、紫花苜蓿等豆科牧草营养品质改良奠定了良好的基础。所以利用GFP检测营养成分的分布和含量将成为分析饲料原料改良效果的有力工具。3.4水生环境检测人类的生产、生活活动对环境的影响逐渐增强，环境日益受到来自生产、生活的废弃物的污染，水质的污染就是一个较为严重的问题，污染物大多是来自工业废物和污水。被污染的水质对鱼体的影响通常表现出生殖机能障碍、雄性鱼体雌性化等。目前，人们已经将生物作为生物传感器的敏感元件来检测污染水平。研究发现可通过将GFP基因重组到可与水中污染物发生反应的启动子中。有研究表明，GFP作为报告基因能够被用来作为转基因有机体连续的定性生物传感器测定水中污染物的水平，并在消除酶或特异性蛋白质试验时，提供快速而有效的结果。3.5酶活测定Malik等发现利用eGFP作为底物，通过测定荧光强度可以测定猪的胃蛋白酶的活性。这种方法有助于准确、直观测定动物肠道内容物消化酶的体外消化能力。3.6营养代谢研究矿物质元素—铁是动物和人健康生长不可或缺的。铁不仅仅是血红蛋白和肌红蛋白的原料，而且还作为多种酶的成分和激活剂参与机体内的物质代谢。所以研究分析铁离子在细胞内的代谢状态将有助于确定饲料中的铁添加量以及探讨铁离子作为营养元素的分子作用机制。Henderson等通过将铁离子反应原件（ironresponsiveelement，IRE）重组到GFP质粒中，发现可以检测活细胞中铁离子调节蛋白（ironregulatoryprotein，IRP）的活力，确定铁离子在细胞内的状态。例如：如果细胞内的铁离子的浓度减少了，那么细胞内的荧光蛋白的含量就减少了，说明IRP结合到了IRE上，并阻断了蛋白质翻译。这为准确分析外源及内源刺激对铁离子代谢的影响提供了动态检测技术。

此外，GFP还被用于时空检测分析磷脂酰纤维醇的代谢与细胞内的钙离子的水平的相关性、维生素Ｅ转运蛋白对维生素Ｅ的转运调节、高氯酸盐在甲状腺细胞中的累积以及测定胰岛素样生长因子Ⅰ、游离脂肪酸的含量等。GFP在代谢方面的推广应用必然带动动物分子营养学的研究。现代成像系统的完善将为动物营养分子代谢的研究提供有力的工具。荧光蛋白基因将作为报告基因将在动物营养成分代谢、酶类活性测定、蛋白质分子动态检测等方面呈现出巨大的优势。荧光蛋白使得变幻无穷的大自然生物现象可视化，这无疑是一大奇迹。荧光蛋白可用于时空监控生物体内的各种生物现象，例如基