高效液相色谱法、气相色谱法

沧州医学高等专科学校药学系吴爽高效液相色谱法、气相色谱法原料药的含量用百分含量（含量%）表示，除另有注明者外，均按重量计，即有效成分的实测量占总量（取样量）的百分率，可表示为药物制剂的含量用百分标示量（标示量%）表示。标示量，是指每一支（片）或其他每一个单位制剂中含有主药的量。如维生素C片规格为50mg，表示每片维生素C片中含主药维生素C为50mg，即标示量为50mg。×100%高效液相色谱法、气相色谱法高效液相色谱法工作流程示意图高效液相色谱法、气相色谱法

高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。高效液相色谱法工作流程示意图高效液相色谱法、气相色谱法高效液相色谱法、气相色谱法自动进样器自混系统泵DAD检测器色谱柱高效液相色谱法、气相色谱法取混合均匀的溶液，经0.45µm的有机膜过滤，再脱气15分钟即可配制流动相把二次蒸馏水和色谱纯级甲醇以15：85的比例混合高效液相色谱法、气相色谱法色谱柱

色谱柱常以5～10μm粒径化学键合硅胶为填充剂，反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最常用，通常称为C18柱、ODS柱。柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。

高效液相色谱法、气相色谱法色谱柱

一般在色谱柱前要求安装保护柱，起到保护延长分析柱寿命的作用。有些物质的分离条件要求有一定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是非常有必要的。

检测器常用紫外检测器，其他常见的有二极管阵列检测器（DAD）、蒸发光散射检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、质谱检测器等。注意：在HPLC法中，各品种标准规定项下的固定相种类、流动相种类、检测器类型不得改变，但其他如色谱柱内径、长度、牌号、流动相流速、流动相比例、柱温、进样量等，均可适当改变。高效液相色谱法、气相色谱法系统适用性试验包括理论板数、分离度、重复性、拖尾因子1、理论板数n=5.54×(tR/wh/2)2分离度（R≥1.5）拖尾因子（应为0.95～1.05）一、高效液相色谱法

（二）系统适用性试验高效液相色谱法、气相色谱法实例解析实例4-1：RP-HPLC法同时测定玄参中肉桂酸、哈巴酯苷的含量。方法：照高效液相色谱法测定，要求本法简便、准确、重现性好。解析：（1）色谱条件：DiamonsilTM(200mm×4.6mm,5µm)，流动相为1%乙酸溶液-甲醇(体积比为49∶51)，检测波长280nm，流速0.9ml/min、柱温32℃，进样量10µl。实例解析实例4-1：RP-HPLC法同时测定玄参中肉桂酸、哈巴酯苷的含量。（2）系统适用性试验：在上述色谱条件下，理论板数按肉桂酸计算不低于5200，按哈巴酯苷计算不低于4100，分离度大于1.5，对称因子分别为1.00，0.96，其HPLC图见下图。1.肉桂酸2.哈巴酯苷A．对照品图谱B.空白样品图谱C.供试品图谱实例4-1：RP-HPLC法同时测定玄参中肉桂酸、哈巴酯苷的含量。（3）重复性试验:取同一对照品溶液，按照上述色谱条件，重复进样5次，计算肉桂酸与哈巴酯苷色谱峰面积的RSD分别为0.29%(n=5)和0.44%(n=5)。实例4-1：（4）含量测定：精密称取玄参药材2.0g，置圆底烧瓶中，加入12倍量70%乙醇溶液，水浴回流1.5小时过滤，重复提取4次，合并滤液，减压蒸干，残渣以10ml水溶解，定量转移至分液漏斗中，以水饱和的正丁醇20ml萃取3次，合并正丁醇层，减压蒸干，残渣以甲醇溶解后，定量转移至10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。以10000r/min离心5分钟，上清液过0.45µm滤膜，取续滤液1.0ml置5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，摇匀即得供试品溶液。制备肉桂酸与哈巴酯苷对照溶液，外标法测定含量(n=3)。玄参中肉桂酸与哈巴酯苷的含量分别为0.031%(RSD为1.4%)与1.7%(RSD为0.77%)。结论：本法可同时测定玄参药材中肉桂酸和哈巴酯苷的含量。（三）含量测定方法与计算1、外标法以被测物质的纯品作为对照品，在相同色谱条件下，以对照品和样品的响应信号进行比较定量的方法。2、内标法以非被测物的另一物质的纯品作为内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应峰面积比与相对响应值，测定待测组分含量的方法。1、外标法按各品种项下规定，精密称（量）取对照品和供试品，分别配成对照品溶液和供试品溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），计算供试品溶液的浓度。计算公式：

（1）原料药含量计算实例解析实例4-2：高效液相色谱外标法测定盐酸环丙沙星（C17H18FN3O3HClH2O）的含量及结果计算。测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L枸橼酸溶液-乙腈（82∶18）用三乙胺调节pH至3.5为流动相，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长为277nm，理论板数按环丙沙星峰计算不低于2000，环丙沙星峰和相邻杂峰间分离度应符合要求。实例4-2：高效液相色谱外标法测定盐酸环丙沙星（C17H18FN3O3HClH2O）的含量及结果计算。供试品的测定精密称取本品51.24mg，置100ml量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密取10µl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取环丙沙星对照品51.07mg，同法测定。已知：本品的水分为2.0%，对照品水分为1.8%。测定数据：AR＝14325，AX＝13004；mx＝50.24mg；mR＝51.07mg。实例解析实例4-2：高效液相色谱外标法测定盐酸环丙沙星（C17H18FN3O3HClH2O）的含量及结果计算。解析：盐酸环丙沙星含量%=结果：符合规定（规定：按无水物计算，含C17H18FN3O3不得少于88.5%）。（2）片剂含量测定与计算实例解析实例4-3：高效液相色谱外标法测定三唑仑片的含量及结果计算。测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（55∶45）为流动相；检测波长为220nm，理论板数按三唑仑峰计算不低于2000。（2）片剂含量测定与计算实例解析实例4-3：高效液相色谱外标法测定三唑仑片的含量及结果计算。供试品的测定取本品（规格：0.25mg/片）50片，称定总重量为0.2010g，研细，精密称取细粉0.09811g，置100ml量瓶中，精密加50%甲醇溶液稀释至刻度，滤过，取续滤液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取三唑仑对照品12.10mg，置100ml量瓶中，精密加50%甲醇溶液稀释至刻度（必要时超声处理），同法测定。测定数据：AR＝9636，AX＝5137，W50＝0.2010g，ms＝0.09811g。已知：标示量＝0.25mg/片。实例解析实例4-3：高效液相色谱外标法测定三唑仑片的含量及结果计算。解析：结果：符合规定[规定：本品含三唑仑（C17H12Cl2N4）应为标示量的90.0%～110.0%]。（3）注射液含量计算实例解析实例4-4：高效液相色谱外标法测定己酸羟孕酮注射液的含量及结果计算。测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（85∶15）为流动相；检测波长为254nm，取己酸羟孕酮对照品与戊酸雌二醇对照适量，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中各含20µg的混合溶液，进行测试，己酸羟孕酮峰与戊酸雌二醇峰的分离度应符合要求。（3）注射液含量计算实例解析实例4-4：高效液相色谱外标法测定己酸羟孕酮注射液的含量及结果计算。供试品的测定用内容量移液管紧密量取本品（规格：2ml：0.25g）2ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10µl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取己酸羟孕酮对照品20.15mg，用甲醇溶液稀释定量稀释成20.15µg/ml溶液，同法测定。测定数据：AR＝3232，AX＝3648实例解析实例4-4：高效液相色谱外标法测定己酸羟孕酮注射液的含量及结果计算。解析：结果：符合规定。[规定：本品含己酸羟孕酮（C27H40O4）应为标示量的90.0%～110.0%]2、内标法按各品种项下的规定，精密称取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子f：

CX=（1）原料药含量计算-内标法实例解析实例4-5：高效液相色谱内标法测定丙酸倍氯米松的百分含量及结果计算。测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（74∶26）为流动相；检测波长为240nm，理论板数按丙酸倍氯米松峰计算不低于2500，丙酸倍氯米松峰和内标峰的分离度应大于4.0。内标溶液的制备：精密称定睾酮适量，加流动相制成浓度为0.1223mg/ml的溶液。（1）原料药含量计算-内标法实例4-5：高效液相色谱内标法测定丙酸倍氯米松的百分含量及结果计算。测定方法：供试品的测定：精密称取本品12.73mg，置100ml量瓶中，加甲醇74ml使溶解，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液10ml与内标溶液5ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取丙酸倍氯米松对照品12.50mg，同法测定。已知本品的干燥失重为0.22%。测定数据：AS＝2027，AR＝4346，AS

΄＝2042，AX＝4487。实例4-5：高效液相色谱内标法测定丙酸倍氯米松的百分含量及结果计算。解析：结果：符合规定。（规定：按干燥品计算，含C28H37ClO7应为97.0%～103.0%）（2）片剂含量计算-内标法（3）注射液含量计算-内标法实例解析实例4-6：高效液相色谱内标法测定十一酸睾酮注射液的含量及结果计算。测定方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-异丙醇-水（43∶43∶

14）为流动相；流速为1.5ml/min；检测波长为240nm，理论板数按丙十一酸睾酮峰计算不低于4000，十一酸睾酮峰和内标峰的分离度应符合要求。内标溶液的制备：精密称定苯丙酸诺龙适量，加甲醇制成浓度为0.6113mg/ml的溶液。实例解析实例4-6：高效液相色谱内标法测定十一酸睾酮注射液的含量及结果计算。测定方法：供试品的测定：用内容量移液管精密量取本品（2ml：0.25g）1ml，置50ml量瓶中，用乙醚分数次洗涤移液管内壁，洗液并入量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml至10ml具塞离心管中，在温水浴中使乙醚挥散；用甲醇振摇提取4次（5ml、5ml、5ml、3ml），每次振摇10分钟后离心15分钟，合并甲醇提取液，置25ml量瓶中，精密加内标溶液5ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10µl注入液相色谱仪，记录色谱图；实例解析实例4-6：高效液相色谱内标法测定十一酸睾