高效液相色谱仪及简单操作维护

第二部分

高效液相色谱仪及简单操作维护

HPLC技术的发展过程HPLC是经典液相色谱的发展，同时是气相色谱理论的扩展和延伸。二十世纪60年代末期生产出商品化液相色谱仪，其发展非常快速，经过30多年的努力已成为分离学科中的骨干技术。目前，HPLC技术已趋于成熟。特点：采用高压泵、高效填料、高灵敏度检测器实现了快速、高效和操作自动化。HPLC和经典液相色谱法的比较

高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱柱长/cm10～2510～200色谱柱柱内径/mm2～10（不锈钢管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒径

μm）3～5075～600流动相流动方式

高压输液泵压入

靠重力流入

溶液的传质、扩散速度

快

缓慢

色谱柱入口压力/MPa

2～200.001～

0.1色谱柱柱效/（理论塔板数/m）2*103～5*1042～50进样量/（g）10-6～10-21～10分析时间/h0.05～1.01～20高效液相色谱法的特点（1）分离效能高：柱效可达5000~30000块/米（2）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程的选择性（3）检测灵敏度高：

UV—最小检出量可以达到10-9g

FD--最小检出量可以达到10-12g（4）分析速度快:采用了高压泵流动相和储液罐（1）储液罐

材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶会避免藻类的生长

容积：0.5~2.0L

放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差

注意：密封、过滤

（2）流动相----使用限制避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂：

碱金属卤化物及其酸溶液，如：碘化锂、氯化钾等

高浓度无机酸，如硝酸、硫酸.

可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)

在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物

含强络合剂的溶液，如EDTA，乙二胺四乙酸

四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液（2）流动相----过滤流动相过滤的目的

过滤去除可能存在的微小固体颗粒

保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法

在线溶剂过滤抽真空过滤流动相在线过滤：

清洁方法：1、用水冲洗残留溶剂后，将过滤器放在约35％浓硝酸里浸一小时2、用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器3、将过滤器重新装好。4、定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（每1～3个月至少清洗一次）不能用超声波清洗流动相抽真空过滤过滤用膜：水系和有机，孔径：0.22µm和0.45µm流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化（2）流动相----脱气常用的脱气方法有：抽真空脱气法：特点：可以一次完成过滤和脱气任务注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系超声波脱气法简单，但效果不理想常用的脱气方法（续）在线真空脱气法

流动相的要求：(1)使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，最好每天更换流动相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours流动相的要求：(2)互溶性流动相的要求：(3)紫外吸收甲醇和水@210nm甲醇和水@254nm乙腈和水@210nm乙腈和水@254nm流动相的要求：

(4)pH的影响高压输液泵和梯度洗脱装置性能：①泵体材料耐化学腐蚀②能在高压下连续工作③输液流量范围宽对填充柱：分析型输出流量为0.1~10ml/min

制备型输出流量为1~100ml/min

对微孔柱：分析型输出流量为10~1000μl/min

制备型输出流量为1~9900μl/min④输出流量稳定、重复性高流量控制的精密度应小于1%（最好为0.5%），重复性最好为0.5%高压泵的分类往复型泵

目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵双柱塞往复式串联泵示意图输液系统的辅助设备

主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置梯度洗脱装置

梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术

影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类

四元低压梯度系统四元高压梯度系统

泵操作注意事项设定泵运转时的高、低压极限2.

缓冲盐溶液与有机溶剂转换时必须用去离子水清洗泵3.

缓冲盐溶液的浓度不能过高，pH范围1～13，Cl-的浓度小于0.1mol/L4.清洗柱塞

注意事项：

1、必须设定高、低压极限

2、

缓冲溶液与有机溶剂转换时用去离子水清洗泵

3、缓冲盐溶液的浓度不能过高，pH范围1～13，Cl-的浓度小于0.1mol/L；

经常使用，每周至少更换一～二次（95%的水）很少使用则每次使用前必须更换泵压力不正常的主要原因：

气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比

例阀故障，传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高

进样装置六通阀进样装置六通阀进样装置正面六通阀进样装置反面连接7725i型六通阀的特点旋转操作时不中断流速可部分充满（可变），也可全部充满(固定)loop孔角度较宽，改善了操作的容易程度进样从1mL到5ml内部有进样信号线（7725i）;容易使用，可靠一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈进样针进完样后及时冲洗进样器，特别是用盐或缓冲液作流动相

（由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈）冲洗方法：

A.将进样器转至Inject和Load位置，利用液相泵输送高纯水冲洗

(这时是冲洗样品环及沟槽）.

B.用阀清洗接头和注射器冲洗。

如何判断手动进样器的密封圈漏？

从进样器观察：进样后将针拔出，若从进样口或排空管有液体冒出，显示密封圈磨损

从结果看：通常有压力不稳定，峰面积或保留时间不稳定和残留严重进样装置自动进样器样品瓶置于进样针下方进样针穿过垫圈进入瓶中注射器抽取所设定的样品体积进样针收回转入针端口使之并成为流路的一部分色谱柱柱材料和规格

﹠不锈钢管

﹠柱管的内径：0.5～

4.6mm﹠填料粒度：3～

10μm﹠柱长度：10～

25

cm色谱柱与仪器的联接不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造成：色谱峰展宽(死体积)、柱效下降或渗漏

锥箍锥度不合适造成渗漏长度不合适造成柱前死体积

自制相应的转换接头

使用“通用”型接头（锥箍及螺母）

锥箍在管上是活动的，即stop-depth的长度可调，能换接不同的色谱系统及色谱柱。如PEEK工程塑料的接头色谱柱色谱性能的评价评价内容：分离效能、对指定溶质的选择型、在不同PH介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重现性、适宜的操作压力等。性能评价方法：以指定的一组标准溶质为样品，测定它们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。测柱效-良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件

定期检测柱效

定期检测仪器的谱带展宽测柱效的方法色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同

各色谱柱均附有说明书,可按说明书所述方法测定

例：Waters反相C18柱的测定方法

流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min

样品:50mgAcenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮进样量5μl

检测波长:254nm计算色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：Wσ方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3σ

93σW4σ

164σW5σ

255σ

不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来柱效低--柱外因素系统连接问题：连接不好造成死体积

进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！色谱柱的正确使用及操作流动相的转换

流速(压力)的变化幅度

温度的变化幅度

专用色谱柱∶样品及溶剂的要求

记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！正确使用色谱柱样品方面

除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用正确使用色谱柱流动相方面

除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度

有机溶剂或水的比例反相C18（硅胶基质）色谱柱的清洗在流动相中添加了一些酸、碱或缓冲盐进行色谱分离后一般的冲洗方法：第一步：用和流动相相同比例的水和有机相冲洗第二步：增大水的比例到90%~95%（最好用梯度）第三步：增大有机相比例到100%（最好用梯度）最后保存在有机相（甲醇或乙腈）中记住∶每种色谱柱可能有特定的方法一定要先看其使用说明！柱压高--柱外因素系统反压问题

阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误?柱压过高，不一定是色谱柱问题！色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂

避免色谱柱床的干涸

避免机械震动

防止细菌生长

注意存放的温度检测器主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。

紫外检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收定量基础：比耳定律，比耳定律光能量∶

I0=入射光强度

I=透过光强度光通量(透过率%)∶T=I/I0吸光度∶

A=-log(T)=log(I0/I)吸光度∶

A=abc溶剂的影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响何为溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收背景吸收的影响背景吸收减少线性范围许多溶剂产生背景吸收影响紫外检测器灵敏度的因素信号强度(S)从比耳定律可看出样品的种类样品浓度及进样的体积检测池的长度所使用的波长，检测器的

时间常数噪音(N)流动相所使用的波长，灯的能量检测器的时间常数非检测器因素-电噪音，泵脉动等定波长检测器紫外检测器种类可变波长检测器二极管阵列检测器紫外-可见光检测器光路示意图可变波长紫外检测器﹠

选用氘灯作为光源，在190—600nm范围内可连续调节，选择不同的波长检测光电二极管阵列检测器（DAD）

DAD检测器的主要特点

①可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比②可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长③在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间—波长—吸收值为坐标的三维图形例：山梨酸和苯甲酸部分分离的色谱峰a.山梨酸b.苯甲酸c.混合物流通池示意图

检测器的维护：

保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗

不定期用强溶剂反向冲洗检测器（流通池）

使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内

检测器灯有一定寿命

平衡和清洗色谱柱时不要开灯，检测中途不要随意开、关灯

基线噪音大可能由那些原因引起泵压不稳：气泡，色谱柱污染，系统管路污染，流通池污染，灯强度不足：光学系统老化或污染，参数设置不合理基线噪音可能的原因：

﹠流通池脏

﹠检测器灯有问题

﹠如果是周期性的，电压或泵的脉冲

﹠温度对检测器的影响

﹠气泡经过检测器Time(min.)基线漂移可能的原因：﹠梯度洗脱﹠温度不稳定(示差检测器）﹠流动相中有污染物﹠柱中的流动相没有平衡﹠体系中有污染物流出鬼峰问题1-流动相脏问题2-容器污染问题3-柱子污染20%-100%MeOH没有进样601530150鬼峰——即使不进样也会出现的峰峰型可能原因：﹠柱中有死体积﹠过滤片部分堵塞﹠只有一个双峰——组分的共洗脱﹠样品与溶剂不匹配，溶剂与柱子不匹配双峰柱塌陷

可能原因：正常峰

双峰峰型可能的原因：部分峰拖尾﹠二次保留效应——残留硅醇基的反应﹠小峰紧跟在大峰的后面流出所有峰拖尾﹠额外的柱效应﹠柱坏/不适当的溶剂﹠柱头有污染﹠金属﹠不适当的样品量拖尾峰称对性

>1.2NormalTailingNormalTailing峰型可能的原因﹠在大峰前，有小峰流出﹠柱死体积﹠样品溶剂不适当﹠过滤片部分堵塞﹠柱过载正常峰伸舌峰前伸峰不对称性

<0.9峰宽*在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的