现代生命科学的发展与人类的生存

现代生命科学的发展与人类的生存

一、核酸的分离、提纯和定量测定

二、核酸的超速离心

三、核酸的凝胶电泳

四、核酸的核苷酸序列测定

五、DNA聚合酶链式反应

六、DNA的化学合成目录一、核酸的分离、提纯和

定量测定

（一）DNA的分离

（二）RNA的分离

（三）核酸含量的测定法（一）DNA的分离真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（DNP)形式存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但不溶于生理盐溶液（0.14molmol/L氯化钠）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L盐溶液，使DNP纤维沉淀出来。使其缠绕在玻璃棒上，再溶解和沉淀多次以纯化。用苯酚抽提，除去蛋白质。苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP一起振荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。如此操作反复多次以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐存在的条件下加2倍体积冷的乙醇，可将DNA沉淀出来。用乙醚和乙醇洗沉淀。用此方法可以得到纯的DNA。用氯仿一辛醇（或异戊醇）与DNP溶液振荡，借助表面变性除去蛋白质，反复多次直至得到不含蛋白质的DNA。此操作过程与苯酚法相似。为了得到大分子DNA，避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入2倍体积含1%（SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K)最后浓度达100ug/mL，在65℃保温4h，蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和蛋白质的部分降解产物。DNA制品中的少量RNA可用纯的RNase分解除去。此方法现在比较常用。氯化铯密度梯度离心（cesiumchloridedensitygradientcentrifugation）也是实验室制备高质量DNA常用的方法。（二）RNA的分离RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3点：①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.196焦碳酸二乙酰（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。②在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)。目前最常用的制备RNA方法有两个：其一，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。异硫氰胍是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都被变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。其二，用胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度<1.33g/cm3,在最上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位于中间。RNA密度>1.89g/cm3，沉在底部。用此方法可制备较大量高纯度的天然RNA。分离poly(A)十mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo(dT)，）亲和层析法。用寡聚（dT)纤维素柱或寡聚（dT）琼脂糖凝胶柱吸附mRNA，洗涤后用低离子强度缓冲液回收mRNA，得到较高质量的制品。不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA.（三）核酸含量的测定法1.紫外分光光度法

2.定磷法

3.定糖法

4.生物材料的处理2.定磷法磷的测定最常用的是钼蓝比色法。此法需先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝，其最大吸收峰在660nm处，在一定范围内溶液光密度与磷含量成正比，据此可以计算出核酸含量。3.定糖法定糖法常用的也是比色法。当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚（地衣酚）反应呈鲜绿色，最大吸收峰在670nm处，反应需要三氯化铁作催化剂。DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm处。此外，还有一些比色反应也可给出灵敏的结果。4.生物材料的处理细胞或组织中核酸含量的测定需要先对生物材料作一定的处理，以便定量提取出核酸的成分。组织预先处理的目的是除去酸溶性含磷化合物及脂溶性含磷化合物。常用冷的5%～10%过氯酸(PCA)或三氯乙酸（TCA）处理粉碎的生物材料，抽提液为酸溶性部分，包括核苷酸，及相对分子质量小的寡核苷酸等。再将残留物用有机溶剂（如乙醇、乙醚、氯仿等）除去脂溶性含磷物质。抽提液中，主要是磷脂类物质。留下的残渣为不溶于酸的非脂类含磷化合物，包括DNA、RNA、蛋白质及少量其他含磷化合物。二、核酸的超速离心

1.核酸的密度测定

2.测定DNA中G-C含量

3.溶液中核酸构象的研究

4.用于核酸的制备1.核酸的密度测定以测定DNA浮力密度为例。将8.0mol几的氯化铯溶液装人离心杯中，DNA样品溶于氯化铯溶液，装在离心杯顶部。开动离心机，以每分钟45000转的速度运转16h以上。此时离心杯中形成线形氯化铯密度梯度，自杯底的1.80g/cm3,到顶部的1.55g/cm3。当DNA样品的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时，DNA形成一稳定的区带，漂浮于氯化铯密度梯度中的一定位置上。此时DNA所处的位置上的氯化铯密度等于DNA的浮力密度。可以用公式直接计算出DNA的浮力密度。不过更方便的办法是应用1一2个已知其浮力密度的标准DNA样品作参考，与未知样品一起离心。待达到平衡后，通过离心机上的光学系统测定DNA与转头的中心轴之间的距离，按下式计算出未知DNA的浮力密度：ρ＝ρ0＋4.2ω2（γ2一γ02）×10-10式中：ρ为未知DNA的密度，ρ0为标准DNA的密度，ω为角速度（弧度／秒），γ为未知DNA与转轴之间的距离，γ0为已知DNA的距离。2.测定DNA中G-C含量G-C碱基对比A-T碱基对之密度大，因为G-C对中有3个氢键。所以含G-C对多的DNA，浮力密度大，含G-C对少的DNA，浮力密度小。而且G-C的百分含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系。因此用这个方法能迅速而精确地测定DNA的碱基成分。Rolfe-Meselson导出了如下计算公式：ρ＝0.100xG-C＋1.6583.溶液中核酸构象的研究RNA只有局部双螺旋结构，它的浮力密度比双链DNA高。双链DNA又比蛋白质的密度高。双螺旋DNA受热变性后成为单链，密度增高。核酸的不同构象具有不同的浮力密度，可利用此技术研究核酸的构象变化及其动力学过程。4.用于核酸的制备应用溴化乙锭一氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA,RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，每分钟65000转（BeckmanL一70超离心机），只要6h可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为每分钟45000转时，则需16h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图15一2),蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降较快，开环及线型DNA沉降较慢。经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布超螺旋DNA闭环质粒DNA开环质及线型DNA蛋白质石蜡油用注射针头从离心管侧面在闭环质粒DNA区带部位刺人，收集这一区带的DNA,用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除去CsCI，再用苯酚抽提1-2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度，可供DNA重组，测定序列及限制酶图谱等之用。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。三、核酸的凝胶电泳

（一）脂糖电泳

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）脂糖电泳

1.影响电泳迁移率因素

2.DNA分析

3.DNA分子片断的测定

4.样品的回收1.影响电泳迁移率因素（1）核酸分子大小迁移率与相对分子质量对数成反比；（2）胶浓度迁移率与胶浓度成反比，常用1%胶分离DNA;（3）DNA的构象一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线型DNA其次，开环DNA最慢。但在胶中加人过多的澳化乙锭时，上述分布次序会发生改变；

（4）电压一般采用5V/cm,在适当的电压差范围内，迁移率与电压大小成正比；（5）碱基组成有一定影响，但影响不大；（6）温度4--30℃都可以，常在室温进行，电流量过大时凝胶温度升高，溶液蒸发，会造成电泳异常。2.DNA分析电泳完毕后，将胶在荧光染料溴化乙锭的水溶液中染色(0.5ug/mL）。溴化乙锭为一扁平分子，很易插人DNA中的碱基对之间。DNA与溴化乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红一橙色可见荧光。1ngDNA即可用此法检出，所以此方法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓度。若在同一胶上加一已知浓度的DNA作参考，则所测得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析与长期保留之用。

3.DNA分子片断的测定应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。实用的方法是在同一胶上加一已知其相对分子质量的样品（如图15-3中的ADNA/Hind皿的片段）。电泳完毕后，经澳化乙锭染色，照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。目前许多试剂公司都能提供各种不同相对分子质量的标准样品。4.样品的回收胶上某一区带在紫外光照射下，切割下来，将切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，让胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳3-4h后，将电极倒转，再通电30-60s，粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提1一2次，水相用乙醇沉淀。这样回收的DNA纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序列分析或作末端标记。回收率在50%以上。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加人交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用予分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳。聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品。但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。聚丙烯酰胺凝胺强度较好，常用垂直板电泳。聚丙烯酰胺凝胶上的RNA样品，经溴化乙锭染色，在紫外光照射下，也能发出荧光，但较暗。这是因为RNA的双螺区较少，其荧光远比DNA为弱，浓度很低的样品不能用此法检测出来，需要用亚甲蓝或银染来显示。四、核酸的核苷酸序列测定

1.Sanger等人提出的酶法（双脱氧链终止法）

2.Maxam和Gilibert提出的化学降解法比较常用的是Sanger的双脱氧链终止法

五、DNA聚合酶链式反应

1.概述

2.步骤

3.应用1.概述聚合酶链反应（PCR）体外扩增DNA已成为应用最广泛的一种生物技术。1985年K.Mullis在研究DNA聚合酶反应时发明了这项技术。最初采用Klenow酶来扩增DNA，但每次加热变性DNA时都会使酶失活，需要重新添加DNA聚合酶，因此使用不方便。1988年Saiki等人用耐热的TaqDNA聚合酶取代Klenow酶之后，才使这项技术成熟，从而得到各方面的应用。2.步骤（1）设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物。（2）优化反应体系，以便获得最好的扩增效果。该反应体系应包括适量模板(1ng～0.001ng)，引物（～100pmol/100ul）,4种dNTP(200umol/L）TaqDNA聚合酶（2u/100ul），和适量Mg（0.05～5mmol/L)。（3）选择3个温度进行热循环。这3个温度为：变性，94℃，45～60s；退火（根据引物与模板的Tm值来定，一般为两引物中较低Tm值减2），1min；延伸，72℃，1min,开始时热变性5～10min，热循环25，检测扩增结果。最普通的检测方法是进行凝胶电泳，用澳化乙锭染色，在紫外光下检查结果。

PCR技术十分灵敏，少数几个模板分子即可检查出来。它的扩增效率非常高，通常可扩增106倍。其扩增产量可按下列公式计算：y＝（1＋x）ny＝产量x＝扩增效率n=循环次数3.应用（1）遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查。（2）病原体的检测。某些恶性疾病用一般微生物学、生化和免疫学技术无法查出病原体时，可用PCR来检查。（3）法医和刑侦鉴定。PCR可灵敏检测出亲属间的亲缘关系，并对生物残留的痕量样品进行鉴定，因此，对刑侦极为有用。

（4）癌基因的检查。（5）基因探针的制备。（6）基因组测序、染色体巡视。（7）cDNA库的构建。（8）基因突变的分析和定位诱变。（9）DN