提高新冠病毒检测灵敏度

提高新冠状病毒核酸检测灵敏度的方法—提高新冠状病毒核酸检测灵敏度的方法—以Trizol试剂为例首先分享中国疾控中心发布的检测新冠病毒的引物、探针序列：推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（openreadingframe,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。Target1（ORF1ab）:正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'Target2（N）:正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'这是个好消息，比较专业的同学一看就明白，根据上述疾控中心提供的资料合成引物探Simgen的2OneStepProbeRT-PCRMxCat.No.40610预混RT-PCR试+PCR检测，仅有RT-PCR试剂是不够的，对于病毒RNA检测来说，病毒RNA提取反RNA（pg级别且容易降解，提取过程费时费力，以至于病毒RNA的回收效率直接就决定了检测的灵敏度，所以才会有一些不负责任的核酸诊断试剂厂家采用了逃避手法：只提供荧光PCR检测试剂，让用户自己去找……Trizol试剂来进行病毒RNA的提取。需要说明的一点是：我们实验室不是P3实验室，不敢玩非冠病毒，我们还是以同样是RNA病毒的丙肝病毒血清样本进行测试的，请大家谅解。(HCV)测试剂盒荧光探针法）105copies/ml。1、用混合的人阴性血清将105copies/ml丙肝病毒阳性血清病毒稀释10104copies/ml104copies/ml10103copies/ml血清。2、Simgen（Cat.No.400205SimgenTrizolCat.No.530110，SimgenCarrierRNA（Cat.No.3HCV检测试剂盒：Acon(PCR-4PCR仪：ABIPRISM®7000SequenceDetectionSystem5、离心机：ThermoBiofugepico二、测试方法1、用SimgenTrizol加CarrierRNA、Trizol103copies/ml血清样本中的病毒RNA。（TrizolTrizol试剂/1mlTrizol试3µlCarrierRNA+200µl750µl+600µl异丙75µlRNase-free水溶解，具体细节请自行脑补）2200µl血清中分离纯化病毒RNA50µl。3、三种病毒RNA提取方法获得的病毒RNA均取10µl作为模板扩增，终反应体积为40µl，使用同一批次的Acon(PCR-)进行扩增。（注：Acon(PCR-荧光法)RT-PCR环数为45个循环，反应条件如下：42℃30min,95℃3min,[95℃10sec,55℃30sec,72℃1min(5)]，[95℃5sec,60℃32sec(40)]）三、实验结果110µl水作为模板，检测结果为阴性。2、用不同方法提取的103copies/ml血清样本，检测结果如下图：四、分析与讨论试剂终究还是扩增起线了，只是CTTrizol剂加了CarrierRNA后起线正常。但是比病毒核酸纯化试剂盒大了差不多两个CT值。Trizol103copies/ml102copies/ml血清样本的时候还能不能起线，所以我建议那些宣传自己产品检测灵敏度高达 102copies/ml现在新闻中也经常在争论新冠病毒核酸检测方法为什么有假阴性的问题RNA样本的特殊性，咽拭子样本的采样方式、保存条件，再到核酸提取，每个环节都有可能会影响到后续PCR检测的灵敏度，所以国家药监局在审批新冠病毒核酸检测试剂盒的时候应该优先通过包含病毒核酸抽提试剂的产品Trizol试剂加了CarrierRNA级的病毒RNAµg级的CarrierRNARNA效率完全就不是一个级别的了，我们一起看下照片：RNA比DNA10℃不失活的强悍RNA酶是罪魁祸首，当CarrierRNA存在时，对于掩护病毒RNA不被RNATrizol试剂提取的病毒RNA扩增曲线趴倒，不排除病毒RNA被降解，导致扩增困难的可能性。TrizolCarrierRNA还是大了两个CTRNA的效率是Trizol试剂+CarrierRNA4倍，怎么解释呢？这要从Trizol试剂提取RNA是+乙酸的混合物，硫氰酸胍负责变性溶解蛋白（是溶解蛋白外壳）；pH值，确保DNA维持不溶解的状态。首先在溶解病毒颗粒的环节，以胍盐溶解蛋白（病毒颗粒）的效率低于蛋白酶K消化蛋白（病毒颗粒），使得病毒RNA的释放效率低了一级，其次又在苯pH（DNApH有助于病毒RNADNA并不干扰病毒RNA的扩增RNATrizol试剂提取病毒RNA效率低的主要原因。其实Trizol试剂用作病毒RNATrizol试剂用作新冠病毒RNA102copies/ml应该是有困难的，如果用Trizol试剂检测某些样本的结果和本次实验相似（趴倒的线），议在Trizol试剂中补加CarrierRNA（此处硬性插入病毒核酸提取纯化试剂盒选择指南：某些不带CarrierRNA的病毒核酸提取试剂盒，比如A**gen，康**纪等公司产品，灵敏度远低于带CarrierRNA的病毒核酸提取试剂盒，注意慎重选择），以免漏检或者误判阳性样本。Trizol试剂提取需要用到