第四章 生物信息的传递 （下）从mRNA到蛋白质合成45

第四章生物信息的传递（下）

从mRNA到蛋白质合成

序.基因与基因表达的一般概念一.遗传密码——三联子二．tRNA三．AA-tRNA合成酶四．核糖体五.蛋白质的生物合成六。蛋白质运转机制本章主要内容序.基因与基因表达的一般概念基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质分子是由许多氨基酸组成的，在不同的蛋白质分子中，氨基酸有着特定的排列顺序，这种特定的排列顺序不是随机的，而是严格按照蛋白质的编码基因中的碱基排列顺序决定的。基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA，再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。翻译的过程也就是蛋白质分子生物合成的过程，在此过程中需要200多种生物大分子参加，其中包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。翻译基本过程（如图：翻译过程的基本原理）、

mRNA----模板

rRNA----构成核糖体作为蛋白质合成场所

tRNA----搬运工具

氨基酸----原料

蛋白质因子(起始因子IF，延伸因子EF，释放因子RF，等等)

酶----氨基酰-tRNA合成酶，转肽酶，转位酶，等

无机离子----Mg++一.遗传密码——三联子1遗传密码概况原核细胞中每种mRNA分子常带有多个功能相关蛋白质的编码信息，以一种多顺反子的形式排列，在翻译过程中可同时合成几种蛋白质，而真核细胞中，每种mRNA一般只带有一种蛋白质编码信息，是单顺反子的形式。mRNA以它分子中的核苷酸排列顺序携带从DNA传递来的遗传信息，作为蛋白质生物合成的直接模板，决定蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。不同的蛋白质有各自不同的mRNA，mRNA除含有编码区外，两端还有非编码区。非编码区对于mRNA的模板活性是必需的，特别是5’端非编码区在蛋白质合成中被认为是与核糖体结合的部位。mRNA分子上以5'→3'方向,从AUG开始每三个连续的核苷酸组成一个密码子,mRNA中的四种碱基可以组成64种密码子。这些密码不仅代表了20种氨基酸，还决定了翻译过程的起始与终止位置。每种氨基酸至少有一种密码子，最多的有6种密码子。从对遗传密码性质的推论到决定各个密码子的含义，进而全部阐明遗传密码，是科学上最杰出的成就之一，科学家们设计了十分出色的遗传学和生物化学实验，于1966年编排出了遗传密码字典。2、三联子密码及其破译50-60年代破译遗传密码方面的三项重要成果：

（1）PaulZamecnik等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。

如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质;

如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。2）FrancisCrick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1:

用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。

实验2:

研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。实验3:

以均聚物为模板指导多肽的合成。在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。实验4:

以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽.

5'…UGUGUGUGUGUGUGUGUG…3'不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。实验5:

以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式：

5’…UUCUUCUUCUUCUUC…3’或5’…UCUUCUUCUUCUUCU…3’或5'…CUUCUUCUUCUUCUU…3'分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.

多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5’…GUAGUAGUAGUAGUA…3’或5’…UAGUAGUAGUAGUAG…3’

或5’…AGUAGUAGUAGUAGU…3’由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。实验6:

以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8种三联子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨基酸组成的多肽。3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。

如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶。

以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。

当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。3、遗传密码的性质（1）起始码与终止码:密码子AUG是起始密码，代表合成肽链的第一个氨基酸的位置，它们位于mRNA5′末端，同时它也是蛋氨酸的密码子，因此原核生物和真核生物多肽链合成的第一个氨基酸都是蛋氨酸，当然少数细菌中也用GUG做为起始码。在真核生物CUG偶尔也用作起始蛋氨酸的密码。密码子UAA，UAG，UGA是肽链成的终止密码，不代表任何氨基酸，它们单独或共同存在于mRNA3’末端。因此翻译是沿着mRNA分子5′→3′方向进行的。（2）密码无标点符号：两个密码子之间没有任何核苷酸隔天，因此从起始码AUG开始，三个碱基代有一个氨基酸，这就构成了一个连续不断的读框，直至终止码。如果在读框中间插入或缺失一个碱基就会造成移码突变，引起突变位点下游氨基排列的错误。（3）密码的简并性：一种氨基酸有几组密码子，或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性，这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸，这对于保证物种的稳定性有一定意义。如：GCU，GCC，GCA，GCG都代表丙氨酸。编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率越高，精氨酸例外（因在真核生物中CG双联子出现的频率较低）见图：“变偶假说”与简并性1、mRNA上的密码子的第一、二碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对。专一性主要由这两个碱基对的作用造成。2、反密码子的第一个碱基决定一个tRNA所能解读的密码子数目（C或A时1个，U或G时2个即U可以与A或G，G可以与U或C）当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3、当一AA由多个密码时，如密码子头2个碱基的任何一个是不同的，则必须有不同的tRNA.4、要求至少有32种tRNA与61种密码子对应（4）密码的通用性：大量的事实证明生命世界从低等到高等，都使用一套密码，也就是说遗传密码在很长的进化时期中保持不变。因此这张密码表是生物界通用的。然而，出乎人们预料的是，真核生物线粒体的密码子有许多不同于通用密码，例如人线粒体中，UGA不是终止码，而是色氨酸的密码子，AGA，AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，加上通用密码中的UAA和UAG，线粒体中共有四组终止码。内部甲硫氨酸密码子有两个，即AUG和AUA；而起始甲硫氨酸密码子有四组，即AUN。在线粒体中发现例外情况（见图）4、密码子和反密码子的相互作用

蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说（变偶假说），解释了反密码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上同源密码子的配对问题。①任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA中的相应碱基形成碱基配对。

②反密码子的5‘位的U被修饰可使之优先与密码子的第三位的A配对胜过与G配对

③反密码子的5‘位的I与密码子的U和C配对优先于A配对

④当一个密码子的头2个碱基与反密码子形成AU对时，则第三个碱基优先用C生成GC对而不用U生成AU对。密码子的使用频率与反密码子的关系二．tRNA序：tRNA(transferRNA)是蛋白质合成中的接合器分子。tRNA分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核蛋白体上，供蛋白质合成使用。tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸，由70～120核苷酸构成，各种tRNA无论在一级结构上，还是在二、三级结构上均有一些共同特点。tRNA中含有10%～20%的稀有碱基，如：甲基化的嘌呤mG、mA，双氢尿嘧啶(DHU)、次黄嘌呤等等。此外，tRNA内还含有一些稀有核苷，如：胸腺嘧啶核糖核苷，假尿嘧啶核苷(Ψ)等。胸腺嘧啶一般存在于DNA中；在假尿嘧啶核苷中，不是通常嘧啶环中1位氮原子，而是嘧啶环中的5位碳原子与戊糖的1′位碳原子之间形成糖苷键。

tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。所有的tRNA都能够与核糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子：反密码子的配对与mRNA相结合，而其3’末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。1、tRNA的三叶草型二级结构最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95个核苷酸不等，tRNA分子长度的不同主要是由其中的两条手臂引起的。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3'端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。

受体臂（acceptorarm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。

TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。

反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。

D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。2．tRNA的L形三级结构酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA的三级结构与AA-tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TφC臂的杆状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。

tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能，因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以两个不同的功能基团最大限度分离。3．tRNA的功能tRNA在蛋白质合成中处于关键地位。tRNA的功能：①运输的工具，运载aa;

②解读mRNA的遗传信息。

它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里tRNA起的是解码作用。

所有的tRNA都能够与核糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子:反密码子的配对与mRNA相结合，而其3’末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。4．tRNA的种类（1）起始tRNA和延伸tRNA

能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA

代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA

校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。

在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。AA-tRNA合成酶的作用是将AA接合于tRNA上。它必须同时能专一性地与AA的侧链基团及与tRNA相结合。原核生物有20种氨酰-tRNA合成酶，每一种专一地对应一种AA。AA-tRNA合成酶多肽链300－900个AA残基，其四级结构差异较大，可是单体、二聚体、同型或异型四聚体。真核生物AA-tRNA合成酶形成特殊的聚集物（如11条多肽链组成的复合物）。大肠杆菌分离出的AA-tRNA合成酶可分成两类，但都具有三个区域：

催化域：ATP和氨基酸结合位点，有2－3个相同的短的AA序列（称“署名序列”）tRNA受体螺旋结合域：插入催化域中，与tRNA接触tRNA反密码子结合域：与tRNA反密码子结合三．AA-tRNA合成酶AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：

它实际上包括两步反应：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。

AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi

第二步是氨酰基转移到tRNA3’末端腺苷残基上，与其2’或3’-羟基结合。

E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP

蛋白质合成的真实性主要决定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸与对应的tRNA相结合。AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。不同的tRNA有不同碱基组成和空间结构，容易被tRNA合成酶所识别，困难的是这些酶如何识别结构上非常相似的氨基酸。tRNA和氨基酰-tRNAtRNA的反密码子环与mRNA的密码配对tRNA的3--端CCA--OH是氨基酸的结合位点氨基酰-tRNA合成酶具有绝对专一性校正活性氨基酰-tRNA的写法氨基酸+tRNA氨基酰-tRNA氨基酰-tRNA合成酶ATPAMP+PPiArg-tRNAargfMet-tRNAfmetMet-tRNAimetMet-tRNAemet

四．核糖体核蛋白体RNA(ribosomalRNA)是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，是蛋白质合成机器内核蛋白体(核糖体)的组成成分。核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。1.核糖体的组成原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。

大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1……S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1……L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。

（1）5SrRNA：由120个aa残基组成，5‘末端附近序列与3’末端附近序列互补，形成“Y”形二级结构。有两个高度保守的区域，其中CGAAC区与tRNA作用，GCGCCGAAUGGUAGU区与23S中一段序列互补。

（2）16SrRNA：由1475－1544个aa残基组成。其3‘端序列ACCUCCUUA与mRNA起始区序列互补，故称解码位点。在蛋白质合成的起始、延伸、终止中起活性作用。

（3）23SrRNA：由2904个aa残基组成，折叠成部分双螺旋结构。其803－811序列高度保守，2030－2615区有与tRNAMet序列互补的片段，这是其肽酰转移酶的2个位点区域。

（4）5.8SrRNA：真核生物大亚基特有，由160个aa残基组成，含有修饰碱基。还含有与原核生物5SrRNA中CGAAC相同的保守序列，以此与tRNA作用和识别。真核生物中还有18SrRNA、28SrRNA等2、rRNA

原核生物rRNA分为5S、16S、23S三种。S是大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位（沉降系数），可反映分子量的大小。小亚基由16SrRNA和21种rps构成，大亚基由5S、23srRNA和31种rpl（核糖核蛋白体）构成。真核生物核蛋白体小亚基含18SrRNA和30多种rps，大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种rpl。各种生物核蛋白体小亚基中的rRNA具有相似的二级结构(图)。16SrRNA00C400C00C＋21S颗粒26S颗粒30S核糖体亚基21S蛋白质含有15S蛋白质含有全部21S蛋白质23SrRNA00C440C00C＋33S颗粒41S颗粒48S颗粒5SrRNAmg2+含有20L含有全部mg2+＋蛋白质34L蛋白质21S蛋白质

50S核糖体亚基核糖体的自我组装3.核糖体的功能核糖体至少有5个活性中心：①mRNA结合位点②AA-tRNA结合位点（A位）

③肽基转移位点（P位）④肽酰-tRNA结合位点⑤转肽酶活性中心此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。小亚基上拥有mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及tRNA携带的功能，如肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。核糖体可解离为亚基或结合成70S/80S颗粒。翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成70S/80S颗粒，继续翻译进程。体外反应体系中，核糖体的解离或结合取决于Mg2+离子浓度。在大肠杆菌内，Mg2+浓度在10-3mol/L以下时，70S解离为亚基，浓度达10-2mol/L时则形成稳定的70S颗粒。细胞中大多数核糖体处于非活性的稳定状态，单独存在，只有少数与mRNA一起形成多聚核糖体。它从mRNA的5'末端向3'末端阅读密码子，至终止子时合成一条完整的多肽链。mRNA上核糖体的多少视mRNA的长短而定，一般40个核苷酸有一个核糖体。五.蛋白质的生物合成蛋白质生的合成亦称为翻译（Translation），即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋折质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。此外，有20种以上的AA-tRNA及合成酶、10多种起始因子、延伸因子及终止因子，30多种tRNA及各种rRNA、mRNA和100种以上翻译后加工酶参与蛋白质合成和加工过程。蛋白质生物合成可分为五个阶段：氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延长、肽链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。真核生物中已发现10余种功能重要的蛋白因子已知功能eIF-1稳定40S、mRNA和Met-tRNA复合物

起eIF-2形成GTP-Met-tRNA起始复合物eIF-2B促进eIF-2的再利用始eIF-3促进40S小亚基的形成eIF-4A辅助mRNA的结合因eIF-4B识别mRNA,具有ATP酶的活性eIF-4C与40S结合，促进80S复合物形成子eIF-4D不详eIF-4E帽子结合蛋白，识别帽子结构eIF-45与60S亚基结合，释放起始因子延伸

EF-1帮助AA-tRNA进入核糖体

因子EF-2负责延伸中的移位释放因子eRF识别终止密码UAG，UAA，UGA（一）氨基酸的活化－氨基酰－tRNA的生成氨基酸在进行合成多肽链之前,必须先经过活化,然后再与其特异的tRNA结合,带到mRNA相应的位置上,这个过程靠氨基酰tRNA合成酶催化,此酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合,生成各种氨基酰tRNA.每种氨基酸都靠其特有合成酶催化,使之和相对应的tRNA结合,在氨基酰tRNA合成酶催化下,利用ATP供能,在氨基酸羧基上进行活化,形成氨基酰-AMP,再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物,此复合物再与特异的tRNA作用,将氨基酰转移到tRNA的氨基酸臂(即3'-末端CCA-OH)上(图)。原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰蛋氨酸tRNA，由N10甲酰四氢叶酸提供甲酰基。而真核细胞没有此过程。运载同一种氨基酸的一组不同tRNA称为同功tRNA。一组同功tRNA由同一种氨酰基tRNA合成酶催化。氨基酰tRNA合成酶对tRNA和氨基酸两者具有专一性，它对氨基酸的识别特异性很高，而对tRNA识别的特异性较低。氨基酰tRNA合成酶选择正确的氨基酸和tRNA：按照一般原理，酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的，只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点，才能合成正确的氨酰基tRNA。合成酶与L形tRNA的内侧面结合，结合点包括接近臂，DHU臂和反密码子臂（图）。

当某些tRNA上的反密码子突变后，但它们所携带的氨基酸却没有改变。1988年，候稚明和Schimmel的实验证明丙氨酸tRNA酸分子的氨基酸臂上G3：U70这两个碱基发生突变时则影响到丙氨酰tRNA合成酶的正确识别，说明G3：U70是丙氨酸tRNA分子决定其本质的主要因素。tRNA分子上决定其携带氨基酸的区域叫做副密码子。一种氨基酰tRNA合成酶可以识别以一组同功tRNA，这说明它们具有共同特征。例如三种丙氨酸tRNA(tRNAAlm/CUA,tRNAAim/GGC,tRNAAin/UGC都具有G3：U70副密码子。）但没有充分的证据说明其它氨基酰tRNA合成酶也识别同功tRNA组中相同的副密码子。另外副密码子也没有固定的位置，也可能并不止一个碱基对。（二）多肽链合成的起始1、大肠杆菌细胞翻译起始复合物形成的过程：（1）核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位：原核生物中每一个mRNA都具有其核糖体结合位点，它是位于AUG上游8-13个核苷酸处的一个短片段叫做SD序列。这段序列正好与30S小亚基中的16srRNA3’端一部分序列互补，因此SD序列也叫做核糖体结合序列，这种互补就意味着核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来起始肽链的合成，该结合反应由起始因子3（IF-3）介导，另外IF-1促进IF-3与小亚基的结合，故先形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。（2）30S前起始复合物的形成：在起始因子2作用下，甲酰蛋氨酰起始tRNA与mRNA分子中的AUG相结合，即密码子与反密码子配对，同时IF3从三元复合物中脱落，形成30S前起始复合物，即IF2-3S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物，此步需要GTP和Mg2+参与。（3）70S起始复合物的形成：50S亚基上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-mRNA-fMet-tRNAfmet复合物。此时fMet-tRNAfmet占据着50S亚基的肽酰位。而A位则空着有待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延长阶段，以上过程见图18-8和图18-9。2、真核细胞蛋白质合成的起始（1）需要特异的起始tRNA即，tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。已发现的真核起始因子有近10种（2）起始复合物形成在mRNA5’端AUG上游的帽子结构，（除某些病毒mRNA外）（3）ATP水解为ADP供给mRNA结合所需要的能量。真核细胞起始复合物的形成过程是：翻译起始也是由eIF-3结合在40S小亚基上而促进80S核糖体解离出60S大亚基开始，同时eIF-2在辅eIF-2作用下，与Met-tRNAfmet及GTP结合，再通过eIF-3及eIF-4C的作用，先结合到40S小亚基，然后再与mRNA结合。mRNA结合到40S小亚基时，除了eIF-3参加外，还需要eIF-1、eIF-4A及eIF-4B并由ATP小解为ADP及Pi来供能，通过帽结合因子与mRNA的帽结合而转移到小亚基上。但是在mRNA5’端并未发现能与小亚基18SRNA配对的S-D序列。目前认为通过帽结合后，mRNA在小亚基上向下游移动而进行扫描，可使mRNA上的起始密码AUG在Met-tRNAfmet的反密码位置固定下来，进行翻译起始。通过eIF-5的作用，可使结合Met-RNAfmet·GTP及mRNAR40S小亚基与60S大亚基结合，形成80S复合物。eIF-5具有GTP酶活性，催化GTP水解为GDP及Pi，并有利于其它起始因子从40S小亚基表面脱落，从而有利于40S与60S两个亚基结合起来，最后经eIF-4D激活而成为具有活性的80SMet-tRNAfmet·mRNA起始复合物。（三）多肽链的延长：（1）为密码子所特定的氨基酸tRNA结合到核蛋白体的A位，称为进位。氨基酰tRNA在进位前需要有三种延长因子的作用，即，热不稳定的EF(EF-Tu),热稳定的EF(EF-Ts)以及依赖GTP的转位因子。EF-Tu首先与GTP结合，然后再与氨基酰tRNA结合成三元复合物，这样的三元复合物才能进入A位。此时GTP水解成GDP，EF-Tu和GDP与结合在A位上的氨基酰tRNA分离（图）。原核生物肽链延长因子EFTu与EFTs的作用原理成肽

转肽酶转位

转位酶（-GTP）mRNA向前移动一个密码子的位置耗能肽链合成方向N端→C端（2）转肽--肽键的形成在70S起始复合物形成过程中，核糖核蛋白体的P位上已结合了起始型甲酰蛋氨酸tRNA，当进位后，P位和A位上各结合了一个氨基酰tRNA，两个氨基酸之间在核糖体转肽酶作用下，P位上的氨基酸提供α-COOH基，与A位上的氨基酸的α-NH2形成肽键，从而使P位上的氨基酸连接到A位氨基酸的氨基上，这就是转肽。转肽后，在A位上形成了一个二肽酰tRNA（图）。肽键的形成①核蛋白体“给位”上携甲酰蛋氨酰基（或肽酰）的tRNA②核蛋白体“受体”上新进入的氨基酰tRNA;③失去甲酰蛋氨酰基（或肽酰）后，即将从核蛋白体脱落的tRNA;④接受甲酰蛋氨酰基（或肽酰）后已增长一个氨基酸残基的肽键（3)移位（Translocation)转肽作用发生后，氨基酸都位于A位，P位上无负荷氨基酸的tRNA就此脱落，核蛋白体沿着mRNA向3’端方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰tRNA的A位转变成了P位，而A位空出，可以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，移位过程需要EF-2，GTP和Mg2+的参加（图）。以后，肽链上每增加一个氨基酸残基，即重复上述进位，转肽，移位的步骤，直至所需的长度，实验证明mRNA上的信息阅读是从5’端向3’端进行，而肽链的延伸是从氮基端到羧基端。所以多肽链合成的方向是N端到C端（图）。（四）翻译的终止及多肽链的释放：无论原核生物还是真核生物都有三种终止密码子UAG，UAA和UGA。没有一个tRNA能够与终止密码子作用，而是靠特殊的蛋白质因子促成终止作用。这类蛋白质因子叫做释放因子，原核生物有三种释放因子：RF1，RF2tRF3。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。RF3的作用还不明确。真核生物中只有一种释放因子eRF，它可以识别三种终止密码子。不管原核生物还是真核生物，释放因子都作用于A位点，使转肽酶活性变为水介酶活性，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末凋上水介下来，然后mRNA与核糖体分离，最后一个tRNA脱落，核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基。解离后的大小亚基又重新参加新的肽链的合成，循环往复，多肽链在核糖体上的合成过程又称核糖体循环（图）UCAUGAUUAmRNA

密码子

密码子

密码子

密码子密码子：mRNA上决定氨基酸的三个相邻的碱基蛋白质合成全过程AAU

亮氨酸ACU

天门冬酰胺AUG

异亮氨酸转运RNA（tRNA)

氨基酸AAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸

tRNA的一端运载着氨基酸AAU

亮氨酸ACU

天门冬氨酸AUG

异亮氨酸

反密码子UCAUGAUUAmRNA

细胞质细胞质中的mRNAUCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨

核糖体mRNA与核糖体结合.UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨

tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子互补配对.UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸

tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置.UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸

两个氨基酸分子缩合缩合UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸

核糖体随着mRNA滑动.另一个tRNA上的碱基与mRNA上的密码子配对.UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸一个个氨基酸分子缩合成链状结构UCAUGAUUAAAU

亮氨酸ACU

天门冬酰氨AUG

异亮氨酸

tRNA离开，再去转运新的氨基酸UCAUGAUUAAAUACUAUG亮氨酸

天门冬酰氨

异亮氨酸以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质.蛋白质合成结构图氨基酸的活化:形成aa-tRNA的两个步骤：①氨基酸接受ATP，形成氨基酰腺苷一磷酸。②氨基酰腺苷一磷酸和tRNA形成aa-tRNA。原核生物中，起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸：Met+tRNAfMet+ATP→Met-tRNAfMet+AMP+PPiN10-甲酰四氢叶酸+Met-tRNAfMet

→四氢叶酸+fMet-tRNAfMet蛋白质生物合成过程小结肽链合成的起始起始反应的主要步骤有：①形成稳定的30S小亚基。②IF-2结合到起始tRNA。③30S起始复合物的形成。④50S亚基参与形成完整的核糖体。肽链合成的延伸⑴后续AA-tRNA与核糖体的结合

第二个AA-tRNA在EF-Tu及GTP的作用下，生成AA-tRNA.EF-Tu.GTP复合物，然后结合到核糖体的A位点。随后GTP被水解释放，通过EF-Ts再生GTP，形成EF-Tu.GTP复合物，进入新一轮循环。⑵肽键的生成

在肽基转移酶（转肽酶）的催化下，A位点上的AA-tRNA转移到P位点，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA从核糖体P位点被挤出。⑶移位

核糖体向mRNA的3’端方向移动一个密码子。使第三位的密码子对应于A位点，准备接受新的AA-tRNA。肽链合成的终止①释放因子水解P位点上多肽链与tRNA之间的二酯键；②新生的肽链及tRNA从核糖体上释放；③核糖体两个亚基解体，蛋白质合成结束。

蛋白质合成动画多核糖体循环：上述只是单个核糖体的翻译过程，事实上在细胞内一条mRNA链上结合着多个核糖体，甚至可多到几百个。蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，引入第一个蛋氨酸，然后核糖体向mRNA的3’端移动一定距离后，第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，现向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。两个核糖体之间有一定的长度间隔，每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率（图）。真核生物蛋白质合成的不同点：1、真核生物蛋白质合成与mRNA的转录生成不偶联2、真核生物蛋白质合成机构更复杂，起始步骤涉及因子很多，过程复杂。3、真核生物蛋白质合成的调控复杂。4、真核生物与原核生物蛋白质合成可为不同的抑制剂所抑制（五）蛋白质合成后的加工修饰1.N端fMet或Met的切除：蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（原核）或Met（真核）开始，多肽合成后，N端的formylgroup、Met残基，有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中，N-端残基的氨基酸会被N-乙基化。

2、二硫键的形成：mRNA上没有胱氨酸的密码子，多肽链中的二硫键，是在肽链合成后，通过二个半胱氨酸的疏基氧化而形成的，二硫键的形成对于许多酶和蛋白质的活性是必需的。3.特定氨基酸的修饰。氨基酸的侧链修饰作用包括：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化等。4、切除新生肽链中非功能片段：许多新合成的肽链要切除非功能段（如信号肽、C－肽）才具有活性。胰岛素、血纤维蛋白、胰蛋白酶等。例如哺乳动物的鸦片样促黑皮激素原初翻译产物为265个氨基酸，它在脑下垂体前叶细胞中，POMC初切割成为N-端片断和C端片段的β-促脂解激素。然后N端片段又被切割成较小的N端片断和工9肽的促肾上腺皮质激素。而在脑下垂体中叶细胞中，β-促脂解激素再次被切割产生β-内啡肽；ACTH也被切割产生13肽的促黑激素（图）。POMC作为多种活性物质的前体

第一行为POMC前体，K、R为赖氨酸和精氨酸残基（六）蛋白质合成的抑制剂（一）抗生素类阻断剂：许多抗生素都是以直接抑制细菌细胞内蛋白质合成而对人体副作用最小为目的而设计的，它们可作用于蛋白质合成的各个环节，包括抑制起始因子，延长因子及核糖核蛋白体的作用等等。1、链霉素、卡那霉素、新霉素等：：①S起始复合物的形成，使氨基酰tRNA从复合物中脱落；②在肽链延伸阶段，使氨基酰tRNA与mRNA错配；③在终止阶段，阻碍终止因了与核蛋白体结合，使已合成的多肽链无法释放，而且还抑制70S核糖体的介离。2、四环素和土霉素：①作用于细菌内30S小亚基，抑制起始复合物的形成，②抑制氨西藏酰tRNA进入核糖体的A位，阻滞肽链的延伸；③影响终止因子与核糖体的结合，使已合成的多肽链不能脱落离核糖体。3、氯霉素：属于广谱抗生素。①氯霉素与核糖体上的A位紧密结合，因此阻碍氨基酰tRNA进入A位，②抑制转肽酶活性，使肽链延伸受到影响，菌体蛋白质不能合成，因此有较哟的抑菌作用。4、白喉霉素它对真核生物的延长因子-2（EF-2）起共价修饰作用，生成EF-2腺苷二磷酸核糖衍生物，从而使EF-2失活，微量就能导致细胞死亡5、嘌呤霉素结构与酪氨酰-tRNA相似，从而取代一些氨基酰tRNA进入核糖体的A位，当延长中的肽转入此异常A位时，容易脱落，终止肽链合成。由于嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰干扰作用，故难于用做抗菌药物，有人试用于肿瘤治疗（图）。（二）干扰素干扰素(IF)是细胞感染病毒后产生的一类蛋白质.可抑制病毒繁殖,保护宿主.六、蛋白质运转机制不论是原核还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质需定位于细胞特定的区域，有些蛋白质合成后要分泌到细胞外，这些蛋白质叫做分必蛋白。在细菌细胞内起作用的蛋白质一般靠扩散作用而分布到它们的目的地。如内膜含有参与能量代谢和营养物质转运的蛋白质；外膜含有促进离子和营养物质进入细胞的蛋白质；在内膜与外膜之间的间隙称为周质，其中含有各种水解酶以及营养物质结合蛋白。真核生物细胞结构更为复杂，而且有多种不同的细胞器，它们又具有各不相同的膜结构，因此合成好的蛋白质还要面临跨越不同的膜而到达细胞器械，有些蛋白质在翻译完成后还要经过多种共价修饰，这个过程叫做翻译后处理。几类主要蛋白质的运转机制：蛋白性质转运机制主要类型分泌在结合核糖体上合成，以翻译-转运同步机制运输免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素细胞器发育在游离核糖体上合成，以翻译后转运机制运输核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质膜的形成两种机制都有质膜、内质网、类囊体中的蛋白质（一）细菌中蛋白质的越膜细胞的内膜蛋白，外膜蛋白和周质蛋白是怎样越过内膜而到其目的地的呢？绝大多数越膜蛋白的N端都具有大约15-30个以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的疏水段能形成一段α螺旋结构。在信号序列之后的一段氨基酸残基也能形成一段α螺旋，两段α螺旋以反平行方式组成一个发夹结构，很容易进入内膜的脂双层结构，一旦分泌蛋白质的N端锚在膜内，后续合成的其它肽段部分将顺利通过膜。疏水性信号肽对于新生肽链跨膜及把它固定的膜上起一个拐掍作用。之后位于内膜外表面的信号肽酶将信号肽序列切除。当蛋白质全部翻译出来后，羧端穿过内膜，在周质中折叠成蛋白质的最终构象（图）。（二）真核生物蛋白质的分泌真核细胞合成的蛋白质N端也有信号肽也能形成两个α螺旋的发夹结构，这个结构可插入到内质网的膜中，将正在合成中的多肽链带和内质网内腔。80年代中期在胞浆中发现一种由小分子RNA和蛋白质共同组成的复合物，它能特异地与信号肽识别而命名为信号肽识别颗粒。它的作用是识别信号肽与核糖体结合并暂时阻断多肽链的合成。内质网外膜上的SRP受体，当ARP与受体结合后，信号肽就可插入内质网进入内腔，被内质网内膜壁上的信号肽酶水解除去SRP与受体结合后，信号肽就可插入内质网进入内腔，被内质网内腔壁上的信号肽酶水解除去SRP与受体解离并进入新的循环，而信号肽后序肽段也进入内质网内腔，并开始继续合成多肽链（图）。SRP对翻译阶段作用的重要生理意义在于：分泌性蛋白及早进入细胞的膜性细胞，能够正确的折叠、进行必要的后期加工与修饰并顺利分泌出细胞。在蛋白质越过内质网的转运过程中，SRP和船坞蛋白（或SRP受体）的作用（三）蛋白质的翻译－运转同步运输

绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个Signalpeptide。该序列常常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有三个特点：（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（Ala或Gly）。研究发现，信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初，一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外，该序列（包括核糖体）就迅速与SRP相结合，诱发SRP与GTP相结合，停止新生肽的进一步延伸（此时新生肽一般长约70个残基左右）。

受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引，这个复合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠拢，并通过peptidetransportcomplex进入ER内腔。翻译-运转同步机制(分泌蛋白途径)分泌蛋白:通过内质网分泌到cell外或细胞间质中的蛋白。游离核糖体：不与细胞内膜结构结合而进行蛋白质合成的核糖体。结合核糖体：与粗面内质网结合的核糖体。信号肽:进入内质网的蛋白质N端有一段长13-36个氨基酸的疏水性肽段，在成熟的分泌蛋白中并不存在，能够引导多肽链穿过ER膜进入ER腔，称为信号肽。信号肽的特点：⑴整体上是一段疏水的肽段；⑵信号肽一般位于N端，进入ER膜后被信号肽酶水解；⑶信号肽的中部常常由10-15个残基构成疏水性核，前端常常有几个带正电荷的碱性氨基酸，后端为为含丙氨酸的区域；⑷信号肽酶的水解位点通常是“Ala-X-Ala”；⑸信号肽可以位于蛋白质分子的各个部位；⑹普遍适用性。信号识别蛋白（SRP）和SRP受体蛋白(DP）SRP是一个小的RNA-蛋白质复合体,它由约300个核苷酸的RNA和6种紧密结合的蛋白质(分子量从9KDa到72KDa)所组成。SRP可以分为两个结构域：（１）信号识别结构域,由RNA的大约第100至第250个核苷酸部分与19KDa、54KDa、68KDa和72KDa蛋白质所构成。（２）由RNA的其余部分与9KDa和14KDa蛋白质所构成,其功能是使肽链的延伸暂停,因而叫做延伸作用制动结构域。SRP的奇特性质是它能够与核糖体相结合并使肽链的延伸暂时受阻,这一作用只有在新生肽链达到大约70个氨基酸长时才发生,因为这时信号序列才从核糖体中冒出来,而余下的30个～40个氨基酸仍然处于核糖体内。SRP对翻译的阻断是暂时的,当它碰到粗面内质网膜上的72KDa的坞蛋白〈dockingprotein)时,就不再阻止核糖体的翻译。这时,SRP离开核糖体而去识别新的信号序列；而核糖体则通过信号肽与粗面内质网膜相连。（四）翻译后运转机制RoughER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体，再分别送到各个亚细胞位点。线粒体蛋白质跨膜运转叶绿体蛋白质跨膜运转蛋白质跨线粒体膜的运输过程有如下特点：线粒体有大约700种蛋白质，其中13种由线粒体基因编码，其它的由核基因组编码。①运输的是翻译结束后的完整蛋白质；②通过线粒体膜的蛋白质在运送前以前体形式存在，由成熟蛋白质加上N末端的一段前导肽组成。③是一个需能过程。蛋白质中的核定位序列一般不被切除。

蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin(α,β亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。核定位蛋白跨核膜运转示意图细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。绝大多数跨膜蛋白的N端也有大约15-30个以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的疏水段能形成一段α螺旋结构。在信号序列之后的一段氨基酸残基也能形成一段α螺旋，两段α-螺旋以反平行方式组成一个发夹结构,它很容易进入内膜的脂双层。这种发夹结构在内膜中立足以后,肽链的继续合成则使信号序列以后肽链穿过内膜而进人周质。当组成发夹结构的两α-螺旋之间的部分到达内膜外表面,位于内膜外表面的信号肽酶将信号序列切除。当蛋白质全部翻译出来之后,竣端穿过内膜,在周质中折叠成蛋白质的最终构象。细菌中蛋白质跨膜运转（五）蛋白质的降解蛋白质降解是一个有序的过程。

在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。

在真核生物中，蛋白质的降解需要依赖于泛素（Ubiquitin），一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr.1×106）。总结本章重点：1、遗传密码的性质（4点）2、tRNA的三叶草型二级结构及功能3、rRNA的种类及核糖体的自我组装4、原核生物蛋白质生物合成的过程＊＊＊5、信号肽及其在翻译-运转同步机制中的作用iTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUl!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+