免疫检测技术第6章 放射免疫技术

(免疫检测技术）第6章放射免疫技术-12第二节放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较思考题小结放射性比度(比放射)

比放射：单位质量或单位体积的放射性物质的放射性活度称为放射性比度其单位有：kBq/kg、μCi/g放射性比度大于70kBq/kg（0.002μCi/g）的任何物质即为放射性比度1、放射性强度：称放射性活度，是度量放射性强弱的物理量。采用的单位有：（1）居里（Curie简写Ci）若放射性同位素每秒有3.7×1010次核衰变，则它的放射性强度为1居里（Ci）。（2）贝可勒尔（Becqurel，简称贝可Bq）1贝可表示放射性同位素每秒有一个原子核衰变。（3）克镭当量放射γ射线的放射性同位素（即γ辐射源）和1克镭（密封在0.5mm厚铂滤片内）在同样条件下所起的电离作用相等时，其放射性强度就称为1克镭当量。

第一节放射免疫技术

早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(radio-immunoassay,RIA，竞争性RIA，又称传统RIA

)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(ImmunoradiometricAssay,

IRMA，非竞争性RIA

)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。

放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。

免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它一、放射免疫技术－原理及分类二、放射免疫技术－常用的放射性核素

125I

3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂γ放射免疫计数器液体闪烁计数器液体闪烁计数器：主要用于探测一些低能β核素示踪原子125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法

聚丙烯酰胺凝胶电泳

高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I125碘-标记物的制备－鉴定

标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性

放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%

免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好

比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/g

mCi/mg

Ci/mmol

比放射性过高，将影响标记物免疫活性计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性

结果准，测定复杂比放射性－计算法

结果欠准，计算简便

自身置换曲线

反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性标准曲线

反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少每分钟脉冲数(CPM)比放射性－自身置换法

标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量

(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性剂量-反应曲线高剂量钩状效应双位点(夹心法)一步法具有很高的特异性，可将受检标本和酶标抗体的两步温育合并为一，较一般的双抗体夹心法省时、简便。但双位点(夹心法)一步法,当待测抗原浓度相当高时，大量过剩抗原是以分别饱和固相抗体和酶标抗体而抑制夹心复合物的形成，这种现象称为“钩状效应（hookeffect）”。表现为阳性反应减弱，严重时可出现假阴性结果。第二节放射免疫分析一、放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。

以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线注：T即是B与F的总和二、放射免疫分析－实验方法及测定抗原抗体反应Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)平衡非平衡一步法二步法分离结合、游离标记物二抗体沉淀法

PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济1．第二抗体沉淀法

其原理是用RIA反应中的试剂抗体(一抗)如豚鼠的IgG免疫另一种动物(如羊)，制得羊抗豚鼠IgG血清(一抗)。RIA反应结束时，加入二抗，使其形成抗原-一抗-二抗的双抗体复合物；但因一抗含量甚微，此复合物也少，不易离心分离，一般还需加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使其与二抗形成较大量的可见沉淀物，与双抗体复合物共沉淀；离心后，即可有效地分离B和F。也可将二抗与某些颗粒固相物连接，制成固相二抗，分离B、F效果也好。

2．聚乙醇(PEG)沉淀法

PEG能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质，而不沉淀小分子抗原，因此PEG被广泛用于RIA实验作沉淀剂。其优点是沉淀完全，经济方便，但非特异性沉淀较多，且当温度高于30~C时，沉淀物易复溶。分离结合、游离标记物3．PR试剂法

先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。是将二抗法和PEG法沉淀原理相结合的方法。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。4.活性炭吸附法

活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白(如抗体和免疫复合物)则留在溶液中。抗原抗体反应后，加入活性炭颗粒，使游离的标记抗原(F)吸附到颗粒上，再离心使颗粒沉淀，上清液中含有的标记抗原抗体复合物(B)供测定。该法主要用于测定小分子抗原或药物的RIA。分离结合、游离标记物测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm，count

per

minute

)计算参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B与F的总和第三节免疫放射分析一、免疫放射分析－基本原理以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量抗原只有一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。二、IRMA与RIA比较放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用1.放射免疫技术的核心是什么？2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.γ闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.灵敏度、特异性和测定范