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文档简介

分子生物学实验（十）湖北民族学院基础医学实验教学示范中心聚合酶链式反应

（polymerasechainreaction,PCR）湖北民族学院医学基础课实验教学示范中心模板DNA：

恩施州土家族人群人血DNA

目的基因：

GSTM1基因

一、实验目的1、熟悉PCR技术的基本原理2、掌握其操作方法3、了解引物设计的一般要求二、实验原理PCR是一种体外扩增特异性DNA片段的技术，可在体外特异的对目的基因进行大量扩增，其巧妙之处在于预先设计合成二段分别与待测目的基因两端互补的引物，以起到指向定点的作用，再借助于DNA聚合酶催化的若干次扩增反应，即可使特定的基因片段成百万次的扩增。

1、变性通过加热使双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。

2、退火当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多与模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。三、

基本反应步骤：

3、延伸在DNA聚合酶和4种dNTP及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点DNA链的延伸反应。以上3步为一个循环，其产物可作为下一循环的模板，经若干次循环，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制。四、试剂（一）制备模板DNA的试剂1、裂解液2、8MKAc3、氯仿4、无水乙醇5、70%乙醇6、TE缓冲液7、RNA酶10mg/ml8、3MNaAc（pH4.8）9、蛋白酶K20mg/ml（二）PCR反应体系1、引物

2、dNTPs3、10×PCRbuffer4、Tap聚合酶

5、模板DNA五、主要实验仪器1、台式高速离心机2、PCR扩增仪3、电泳仪、电泳槽4、可调式微量加样器及吸头5、凝胶成像系统六、实验步骤（一）PCR反应1、按下列次序将各组分加入0.2ml灭菌管内并混合。10×PCRbuffer8μldNTPs200mmol/L引物10.2mmol/L引物2100pmolTaq酶1.5u模板DNA100ng加水至总体积25μl2、94℃预变性3min。3、94℃1min→59℃

1min

→72℃

1.5min

共35个循环。4、72℃延伸10min。5、冷却至4

℃用于电泳或转至-20℃保存。（二）PCR产物的凝胶电泳分析

PCR产物可通过凝胶电泳检测其扩增片段大小，以及有无预期特定片段长度DNA扩增产物的生成，分析PCR的效果及特异性，或

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