第二章-培养基灭菌1

第二章培养基灭菌

微生物的培养过程：培养基配制→灭菌→接种→培养

为什么要进行培养基灭菌？

1)

生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。2)

由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。3)

污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。4)

发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。需要无菌的单元和措施:1)培养基和设备需经灭菌2)好氧培养过程中使用的空气应经除菌处理3)设备应严密，生物反应器中要维持高于环境压力4)

使用无污染的纯粹种子5)培养过程中加入的物料也要经过灭菌

无菌状态:从系统中杀死或者清除所有活的微生物和他们的孢子.培养基的灭菌：杀灭或者除去培养基中有生活能力的细菌营养体及其孢子。杀灭比除去杂菌更加常用。灭菌:是指用物理或化学方法杀灭物料或设备中的一切生命物质的过程。

常见的灭菌和消毒的物理方法常用控菌的化学方法常用的灭菌方法:湿热灭菌SteamSterilization(121℃,20-30min）干热灭菌Dryheatsterilization（160℃保温1～2h,玻璃器皿等）化学除菌过滤除菌Filtration(澄清流体的除菌,air)射线灭菌Irradiation（紫外线穿透力低，仅用于表面消毒和空气的消毒）进行培养基灭菌的操作方式分批（间歇）灭菌连续灭菌对液体培养基的湿热灭菌是指：将培养基中杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N，至于所需的温度和时间，决定于杂菌孢子的热死灭动力学培养基中有效成分受热破坏的可接受程度反应器的形式和操作方法

微生物的热死灭动力学（对数残留定律）

对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。

N：培养基中任一时刻的活微生物浓度（个/L）t：灭菌时间minK：比热死亡速率常数min-1

均相系统，它符合化学反应的一级反应动力学。

上式适合于灭菌过程的任意时刻。为了对灭菌全过程进行考虑，上式作

变上限积分，取边界条件t0=0N=N0积分式：ln:存活率,无菌程度；t：灭菌时间

将存活率与灭菌时间t在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。直线斜率K。K值越大表示微生物越容易死亡ln

K（比热死亡速率常数）由两个因素决定1、灭菌温度2、微生物的种类和存在方式在一定温度下，比热死亡速率常数K随微生物种类不同而不同。例如，在121℃，枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.047～0.063s-1；梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03s-1；嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013s-1。

即使同一种微生物，其营养细胞和芽胞的K值也有很大的差别，营养细胞易于受热死亡，K值很高。120℃灭菌K值可大致为1010（min-1）数量级，而细菌孢子的K值在120℃只有10数量级，下表是典型微生物培养环境中各种微生物对湿热灭菌的相对热阻。微生物的热死灭动力学热阻越大，越不易杀灭，K值小。对培养基进行热灭菌，必须以细菌的孢子为杀灭对象。

微生物的热死灭动力学

K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更重要的是温度T对K的影响，这是热灭菌工程设计中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？）

K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示：式中A：频率因子，min-1△E：菌体死灭反应活化能，J/mol

R：气体常数8.28J/mol·K T：绝对温度微生物的热死灭动力学

在对培养基进行热灭菌时，在杂菌死亡的同时，培养基中一些不太稳定的成分也会因受热而破坏，例如：糖溶液会焦化，蛋白质会变性，维生素失去活性，醛糖与氨基化合物反应——美拉德反应，一些化合物会发生水解。

营养物质的受热破坏也可以看作一级反应：ln(C/C0)

=-Kd

t

C：对热不稳定物质的浓度Kd:热不稳定物质的分解速率常数s-1。

分解速率常数Kd随物质种类和温度而不同（营养物质中维生素最容易被破坏，Kd最大），温度对Kd

的影响也遵循阿伦尼乌斯方程：A′：系数； R：气体常数；T：绝对温度△E′：不稳定物质热分解反应的活化能。

ln(N/N0)

=-K

tln(C/C0)

=-Kd

t杂菌营养物质△T△K

△KdK对T的变化率是怎么样的？

从上式可以做如下几点分析：（1）△E值可求

上式取对数得：ln

K=-△E/RT+lnA

不同种的微生物的热死灭反应的△E各不相同，对于某种微生物，在一定的T下作灭菌实验，求得相应的K值，按lnK——1/T作图，从直线的斜率可求出△E。微生物的热死灭动力学（2）K、△E、T三者之间的关系

K=f(△E、T)一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么在热灭菌过程中能控制的因素是什么：

温度T那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好呢？（这是要讨论解决的问题）从式子ln

K=-△E/RT+lnA来看，T升高，K增大灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养的破坏程度。对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E不同。K增大的幅度还取决于△E。

求一个变量（K）对另一个变量（T）的变化率是导数问题。对ln

K=-△E/RT+lnA

两边求T的导数d(lnK)/dT=△E/RT2，d(lnKd)/dT=△E’/RT2现在看

和△E的关系：越大。△E越大，

灭菌动力学的重要结论

细菌孢子热死灭反应的△E很高，而大部分营养物质热破坏反应的△E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率K，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)

=-K

t）；由于营养成分热破坏的△E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏程度Kd，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。结论：提高温度对培养基灭菌更有利。高温短时灭菌既能快速灭菌，又能有效保存培养基中一些有效成分例：

嗜热脂肪芽胞杆菌孢子和维生素B1的热处理数据（一定T下，ln(N/N0)

=-K

t），就不同的T，求得前者的比热死亡速率常数KBS和后者的比破坏速率常数KVB，按lnK——1/T标会，得图，由图算出：△EBS=67000×4.184J/mol△EVB=22000×4.184J/molln

K=-△E/RT+lnA

根据上图，若把灭菌温度从105℃（1/T=2.64×10-3）提高到127℃（1/T=2.50×10-3

），则KVB从0.02min-1增大到0.06min-1，KBS从0.12增大到40.0min-1，也就是说，灭菌温度提高了22℃，嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的比热死亡速率增大330倍，而维生素