血清碱性磷酸酶的活性测定

血清碱性磷酸酶活力的测定磷酸苯二钠法

生化试验第三组实验目的1.熟悉酶活力测定方法的一般原理2.掌握血清碱性磷酸酶(ALP)的测定原理与临床意义。3.酶活力测定的目的是了解组织提取液、体液中酶的存在于含量。实验原理一.基本概念1.酶活力测定酶的催化功能可以用在一定条件下酶所催化的某一特定化学反应的速度来表示。反应速度越快，酶活力越高;反之，活力越低。测定酶活力实际上是测定酶促反应速率。2.酶的活力单位a.国际在特定的条件下，1min内将1μmol底物转化为产物所需的酶量为1个国际单位(IU)。1IU=16.67×10-9Katalb.临床上采用金氏（Kings）的定义：每100ml血清在37℃与底物作用15min，产生苯酚1mg的酶量为1个金氏单位。c.Kat单位在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量。1Kat=6×107IU实验原理二.测定方法1.终止测定法（定时法或终点法）是当酶促反应进行到一定时间点，通过物理或化学方法(强酸、强碱、蛋白沉淀剂）终止反应。动力学分析法（连续监测法或速率法）在酶促反应过程中，用仪器连续监测酶促反应产物或底物的变化量，通过计算求出酶的活性。实验原理测定ALP活力分两种1.测定底物解离下的磷酸根来计算。如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的缺点。2.测定底物解离后的羟基化合物A.在显色剂的作用下显色比色测定（本次）B.生成的酚化合物本身在一定条件下就可以显色（对硝基苯磷酸二钠法）实验原理三.核心原理ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率可用分光光度计监测，从而计算ALP活力的大小磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢二钠苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌亚胺衍生物ALPPH10试剂碳酸盐缓冲液（0.1mol/LPH10.0)无水碳酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕色瓶贮存。磷酸苯二钠底物液（20mmol/L)先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。显色液铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏水至1L，棕色瓶避光保存。酚标准工作液0.05mg/ml实验操作试剂/ml测定管（T）标准管（S)空白管（B）对照管（C）血液0.100---------酚标准液---0.100------蒸馏水------0.100---PH10碳酸盐缓冲液1.001.001.001.00混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热底物液1.001.001.001.00混匀，37℃水浴保温15min铁氰化钾溶液3.003.003.003.00血清---------0.100立即混匀，在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度计算公式

注意事项1.铁氰化钾应避光保存，如出现蓝绿色即作废。铁氰化钾的水溶液受到光线的作用，就会分解成黄血盐钾K4[Fe(CN)6]2.底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠开始分解，不宜继续使用3.加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则显色不充分临床意义1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖高脂肪食物等使ALP活性升高2.病理性改变A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝癌）