SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

班级：生工xxx姓名：xxx一同组人：xxx

学号：xxxx

日期：xxxx银染是迄今为止灵敏度最高的一种染色法。是对SDS凝胶中的蛋白质进行染色时最常用的方法其基本原理是银离子与蛋白质分子上的酸基COO-）结合,然后银离子被还原为自由的银,可使蛋白质条带呈现深棕至黑色。银染基本上可以分为酸性和碱性2种方法。碱性方法非常敏感,但是需要较长的步骤。酸性方法快速但是灵敏度较低。银染的优点在于灵敏度高,其缺点在于:可能造成很高的背景,特别在水不够纯的情况下；费时费力（需要8〜16h）；费用昂贵；需要接触有毒的甲醛,而且核酸、脂多糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰。荧光法[3]针对考马斯亮兰染色虽然快速但是灵敏度不够,银染法虽然灵敏度高但是背景较高,结果容易受到核酸污染等缺点,人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色。这些荧光染料有Fluoresceinisothiocyanate,dansylchloride,rhodamineisothiocyanate等。这些荧光染色方法需要在电泳之前荧光染料与一定的功能基团相结合。共价结合的荧光标签在蛋白质检测方面非常敏感,超过了考马斯亮兰。4.3.3负染法[3]负染的原理主要是有选择的将金属离子沉淀在胶上,蛋白质条带不能被染色,因此,它们所处的位置是透明的。这种方法非常简单快速。但是,这种方法的重复性依赖于许多物理化学因素（例如染色液的pH，胶中阴离子的浓度、温度等）。所以,它不能作为一种通常运用的方法。但是,与其他方法相比,该方法允许蛋白质保持完整并有效回收以做进一步的结构和生物学分析。特别是在运用咪唑锌进行负染时,凝胶中锌介导的蛋白质固定是完全可以逆转的,洗脱后的蛋白质没有受到化学修饰,也没有受到有机物的污染,咪唑锌或者改进后的咪唑-SDS-锌染色法灵敏度接近于银染（1-10ng）,重复性优于用铜或者锌进行的负染。注意事项制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力或用一旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。凝胶完全聚合后，必须放置30min至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100Rg蛋白/100℃比。在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。电泳后，应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。为保证电泳结果满意，最好使用新稀释的缓冲液［2］。5参考文献［1］李文蓉，许键，喻梅辉.几种SDS蛋白质染色方法的比较［口.八一农学院学报,1993,16(3):32-35.［2］分子生物学实验指导.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳