生物化学实验课件：实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法

实验四：蛋白质的定量测定

考马斯亮蓝法（Bradford）和BCA法蛋白质检测及含量的测定一、化学检测1、凯氏定氮法（Kjeldahl)：0.2~1.0mg/ml(平均含氮量16%)2、双缩脲法（Biuret）：1~10mg/ml（肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色）3、Folin-酚试剂法（Lowry）：20-250mg/ml（干扰因素多）4、考马斯亮蓝法（Bradford）：10~100mg/ml（受蛋白质内氨基酸组成影响较大）5、BCA法（bicinchoninicacid二喹林甲酸）：5-200mg/ml；MicroBCA：0.5-20mg/ml；二、光学检测1、荧光检测：邻苯二甲醛（OPT）法，强还原剂与氨基酸/肽反应产生强荧光性化合物，激发波长为340nm,荧光波长为455nm，可用于氨基酸自动分析系统。2、紫外光检测：10mg/ml（芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收）三、电泳或免疫化学检测：如PAGE、WesternBlot、ELISA等实验目的及要求掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）原理掌握BCA法的原理掌握标准曲线法制备方法考马斯亮蓝G250（CoomassiaBrilliantBlueG-250）能在酸性溶液中与蛋白质的疏水区结合，最大光吸收峰从405nm变为595nm，溶液的颜色也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至少在1小时内是稳定的。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。Bradford法原理优点：灵敏度高，0-100g/ml；测定快速、简便，颜色可以在1小时内保持稳定;干扰物质少。

缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；去污剂、甘油、乙酸和0.1M的NaOH会干扰此法的测定。BCA法原理BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，Bicinchoninicacid）能与含二价铜离子的硫酸铜组成BCA工作试剂。在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色复合物。在562nm处显示强吸光性。在一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。

优点：准确灵敏,5-200g/ml;测定快速简便；经济实用;干扰物质少；检测不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradford法

缺点：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够。蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果。每种蛋白质测定法各有其优缺点在选择方法时应考虑的因素①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间实验内容1、制备蛋白样品；2、分别制作两种测定方法的标准曲线；3、分别用两种方法测定样品。实验流程1、制备总蛋白样品：

小白菜（梗+叶）10g，碾成匀浆，加水10ml后继续碾10min，倒入离心管中，另加20ml水将剩余物洗入两个50ml离心管，称重平衡后，10000r/min离心10min。小心地每管取2.5ml，一共5ml定容到50ml，待测。用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。注意：1.取叶和梗的差别，蛋白含量有差异2.两个离心管要称重平衡，对面放置在离心机中3.取上清要小心，所取液体要澄清4.剩余上清，保留，量体积管号

ml样品1234567C白菜抽提液标准蛋白质200mg/ml0？？？？？？X’X1X2X3H2O1？？？？？？Y’Y1Y2Y3考马斯亮蓝G-250溶液55555555555混匀，室温放置10min吸光度值（A595）每管蛋白质的含量（mg）2、Bradford法（10-100mg/ml）X’+Y’=1ml（10-200mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液注意：1.移液器垂直加样到试管底，不要挂壁！2.两种标曲吸光度不同！管号

ml样品1234567C白菜抽提液标准蛋白质200mg/ml00.050.10.20.30.450.5X’X10.1X20.2X30.3H2O10.950.90.80.70.550.5Y’Y10.9Y20.8Y30.7考马斯亮蓝G-250溶液55555555555混匀，室温放置10min吸光度值（A595）每管蛋白质的含量（mg）Bradford法X’+Y’=1ml（10-200mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液注意：1.移液器垂直加样到试管底，不要挂壁！2.两种标曲吸光度不同！3、BCA法（20-200mg/ml）管号

ml样品123456C’白菜抽提液标准蛋白质200mg/mlX’X1’X2’X3’H2OY’Y1’Y2’Y3’BCA工作液2222222222混匀，60度温育30min，冷却至室温吸光度值（A562）每管蛋白质含量(mg)X’+Y’=1ml（5-200mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液注意：1.移液器垂直加样到试管底，不要挂壁！2.两种标曲吸光度不同！BCA法（20-200mg/ml）管号

ml样品123456C’白菜抽提液标准蛋白质200mg/ml00.10.20.40.81X’X1’0.02X2’0.05X3’0.1H2O10.90.80.60.20Y’Y1’0.98Y2’0.95Y3’0.9BCA工作液2222222222混匀，60度温育30min，冷却至室温吸光度值（A562）每管蛋白质含量(mg)X’+Y’=1ml（5-200mg/ml）C为未知浓度蛋白质溶液注意：1.移液器垂直加样到试管底，不要挂壁！2.两种标曲吸光度不同！注意1、自己制备的蛋白质溶液测定含量时，注意稀释度控制在测定范围内。2、蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀，有沉淀应过滤除去。3、染料与蛋白质结合后，形成的蓝色复合物易轻度沾附试管壁或比色皿，每次使用不能用有着色的比色皿。使用完后应立即用95%乙醇清洗干净。分别绘制两种方法测定蛋白质含量的标准曲线。分别用两种方法测定每g小白菜中的蛋白质是多少（μg/g）。计算标准曲线的制作蛋白质标准曲线00.020.040.060.080.10.120.1400.20.40.60