高中生物竞赛：核酸的结构和功能课件

第二章

核酸的结构和功能StructureandFunctionofNucleicAcid一、核酸的发现和研究工作进展1868年FridrichMiescher从脓细胞中提取“核素”

1944年

Avery等人证实DNA是遗传物质1953年

Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年Nirenberg发现遗传密码1975年Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1985年Mullis发明PCR技术1990年美国启动人类基因组计划(HGP)

1994年中国人类基因组计划启动2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架二、核酸的种类及分布90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸

核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。生物化学• DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。• DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。• DNA主要分布于细胞核中；线粒体和叶绿体中也有DNA。1、脱氧核糖核酸（DNA）生物化学2、核糖核酸（RNA）• RNA主要分布于细胞质和细胞核中。• RNA为单链分子。• RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。但RNA在细胞中的含量比DNA高。生物化学RNA的类别• 原核和真核细胞中都含有三种主要RNA：mRNA（信使RNA）（5%）tRNA（转运RNA）（10-15%）rRNA（核糖体RNA）（80%）• 真核细胞中还含有其它的RNA：hnRNA（核不均RNA）——mRNA的前体物SnRNA（核小RNA）——参与RNA的加工Eukaryote真核Prokaryote原核

DNA细胞核（95%）Organelles(Mit,Chl)（5%）核质区（拟核）

RNA细胞质（75%）Organelles(Mit,Chl)

（15%）细胞核（10%）细胞质核酸的分布第一节核酸的化学组成及其一级结构TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid核酸的化学组成1.元素组成C、H、O、N、P（9~10%）2.分子组成——碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱——戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖——磷酸(phosphate)嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)碱基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)嘧啶环和嘌呤环的编号以及各种碱基的化学结构碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。生物化学嘧啶碱基和嘌呤碱基最重要的功能基团是环上的氮和羰基，以及环外的氨基。几种修饰核苷多数为主要碱基的修饰产物或代谢产物,在体内含量甚少的碱基。tRNA中大约有10%的稀有碱基碱基几乎不溶于水，这与其芳香族的杂环结构有关。互变异构酸碱解离强烈的紫外吸收，其最大吸收值在260nm。碱基的性质碱基的互变异构（在体内主要以酮式和氨基式为主）生物化学强烈的紫外吸收嘌呤碱基和嘧啶碱基分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有强烈吸收（260nm左右）。碱基的紫外吸收性质是定性或定量测定碱基和核苷酸、核酸的依据。戊糖（构成RNA）1´2´3´4´5´核糖(ribose)（构成DNA）脱氧核糖(deoxyribose)β-D-核糖β-D-2-脱氧核糖一、核苷酸的结构1.核苷(ribonucleoside)的形成核苷＝戊糖＋碱基，嘌呤的N9或嘧啶的N1与戊糖C-1'-OH以C-N糖苷键相连接。腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷一、核苷酸的结构1.核苷(ribonucleoside)的形成天然核苷：一般为反式构象一、核苷酸的结构1.核苷(ribonucleoside)的形成核苷＝戊糖＋碱基，嘌呤的N9或嘧啶的N1与戊糖C-1'-OH以C-N糖苷键相连接。核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

2.核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。

由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子。pI=1/2(pk1′+pk2′)

pH<pI,

核苷酸带正电pH>pI,

核苷酸带负电在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸的等电点：两性解离和等电点核苷酸的解离曲线pK1=0.9第一磷酸基pK3=6.2第二磷酸基pK2=3.7含氮环腺嘌呤核苷酸pK1=0.7第一磷酸基pK3=6.1第二磷酸基pK2=3.7含氮环烯醇式羟基鸟嘌呤核苷酸pK1=0.8第一磷酸基pK3=6.3第二磷酸基pK2=4.3含氮环胞嘧啶核苷酸pK1=1.0第一磷酸基pK3=6.4第二磷酸基烯醇式羟基尿嘧啶核苷酸pH胞嘧啶核苷酸的解离：第一磷酸基（—PO3H2）解离含N环（═N+H—）解离第二磷酸基（—PO3H-）解离鸟嘌呤核苷酸的解离pI5’-GMP＝1.55腺嘌呤核苷酸的解离pI5’-AMP＝2.35尿嘧啶核苷酸的解离可在pH2.0～5.0之间分离各种核苷酸pH3.5时各核苷酸所带电荷核苷酸磷酸基电荷碱基的电荷净电荷AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1电泳时移动速度顺序是：UMPGMPAMPCMP体内重要的游离核苷酸及其衍生物含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD

等都含有

AMP

多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP

环化核苷酸:cAMP，cGMPAMPADPATPcAMPNADP+NAD+5´端3´端3.核苷酸的连接核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。CGA能量货币，通常是ATP，有时使用UTP（糖原合成）、CTP（磷脂合成）和GTP（蛋白质合成）；核酸合成的前体：NTP→RNA，dNTP→DNA；信号转导，例如cAMP和cGMP作为某些激素的第二信使，鸟苷酸能够调节G蛋白的活性；作为其他物质的前体或辅酶/辅基的成分，如ADP为辅酶I和II的组分，鸟苷酸作为第一类内含子的辅酶；活化的中间物，如UDPGlc和CDP-乙醇胺分别参与糖原和磷脂酰乙醇胺的合成；作为酶的别构效应物参与代谢的调节，如ATP为磷酸果糖激酶-1的负别构效应物，AMP作为糖原磷酸化酶的正别构效应物;调节基因表达。例如ppGpp和pppGpp参与调节原核细胞蛋白质的合成。核苷酸的生物功能二、核酸的一级结构定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5′端3′端CGAAGP5PTPGPCPTPOH3书写方法5pApCpTpGpCpT-OH

35

ACTGCT

3目录5pACTGCTOH

3第二节DNA的空间结构与功能DimensionalStructureandFunctionofDNA一、DNA的二级结构——双螺旋结构（一）DNA双螺旋结构的研究背景

碱基组成分析Chargaff规则：[A]=

[T][G]

[C]

碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理DNA纤维的X-线衍射图谱分析目录生物化学（二）DNA双螺旋结构的要点（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′→3′，而另一条链的方向为3′→5′。生物化学（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。生物化学（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4nm。生物化学腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。生物化学（5）螺旋表面形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。双螺旋结构模型(doublehelixmodel)要点（1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧（2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴（3）右手双螺旋：螺距为3.4nm，直径为2.0nm，10bp/圈（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础（5）维持结构稳定的力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定氢键氢键固然重要，但它们主要决定碱基配对的特异性，而对双螺旋稳定的贡献不是最重要的。对双螺旋稳定起决定性作用的是碱基的堆集力。碱基堆集力这是碱基对之间在垂直方向上的相互作用所产生的力。它包括疏水作用和范德华力。碱基间相互作用的强度与相邻碱基之间环重叠的面积成正比。总的趋势是嘌呤与嘌呤之间>嘌呤与嘧啶之间>嘧啶与嘧啶之间。另外碱基的甲基化能提高碱基的堆积力。阳离子或带正电荷的化合物对磷酸基团的中和双螺旋稳定的因素（三）DNA双螺旋结构的多样性目录生物化学DNA双螺旋的类型• (1)B-DNA螺旋：DNA在92%相对湿度的钠盐中的构型。典型的“Watson-Crick”右手双螺旋DNA，细胞正常状态下DNA存在的构型。碱基平面与长轴完全垂直• (2)A-DNA螺旋：DNA在75%相对湿度的钠盐中的构型。右手双螺旋DNA,螺旋直径更大，折叠更紧密• (3)Z-DNA螺旋：左手DNA螺旋，这种螺旋可能在基因表达的调控中起作用。三种DNA双螺旋结构的比较类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）碱基对与水平面的倾角（°）A-DNA右2.552.47110.23+19B-DNA右2.373.32100.33±0.02－1.2+4.1Z-DNA左1.844.56120.38－9DNA中存在不少如图所示的二重对称结构，即一条链碱基序列的正读与另一条链碱基序列的反读是相同的。这种序列也可称作反向重复顺序或者回文顺序，这样的序列很容易形成发夹结构或十字架结构。有些回文顺序可以作为限制性核酸内切酶的识别位点，还有些回文顺序形成的发夹结构在转录的终止，或转录活性的调控方面发挥重要作用。十字形DNA的形成DNA的镜像重复可能形成三螺旋DNA的结构。在三螺旋结构中，存在T-A*T，C-G*C+，T-A*A和C-G*G四种三联碱基配对，其中的“-”表示，Wotson-Crick碱基对，“*”表示Hoogsteen碱基配对这种碱基配对是Hoogsteen于1963年首先发现的，因此而得名。（三）DNA在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。核小体的组成DNA：约200bp组蛋白：H1H2A，H2BH3H4真核生物染色体的结构真核细胞的染色质是双螺旋线形分子，双螺旋DNA先盘绕组蛋白形成核小体，或称核粒，许多核小体由DNA链连在一起构成串珠状结构。每个核小体由DNA分子在组蛋白核心外面缠绕约1.75圈（约146bp）

构成，直径约11nm。

核小体的电镜照片

由核小体形成的串珠状结构进一步盘绕成直径30nm的螺线管形，每圈6个核小体。后者与染色体骨架蛋白质结合形成大的突环结构，或称之为超螺线管结构，经进一步折叠形成微带结构，最后折叠形成染色体，使DNA的长度压缩约10000倍。三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。第三节

RNA的结构与功能StructureandFunctionofRNARNA的种类、分布、功能不同类型的RNA的功能和分布不同类型的RNA的功能和分布RNA的一级结构是由数量极其庞大的四种核糖核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按一定顺序，通过3´,5´—磷酸二酯键连成的线形分子，其表示方法与DNA相同。RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。RNA的三级结构是在茎环结构基础上进一步扭曲折叠而成的复杂结构。RNA的结构生物化学这种由单链自身折叠形成的结构称为茎环结构。茎环结构是各种RNA的共同的二级结构特征。生物化学• 在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C 对外，也可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。一、信使RNA的结构与功能hnRNA内含子(intron)mRNA*mRNA成熟过程

外显子(exon)目录生物化学mRNA的结构信使RNA（messengerRNA，mRNA）不均一核RNA（heterogeneounuclearRNA，hnRNA）：在细胞核内合成的mRNA的初级产物，经过剪接成为成熟的mRNA并移到细胞质。• mRNA的功能：是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。1、mRNA一级结构的特点真核生物成熟mRNA的结构特点及与原核生物的区别：1）5’端帽子结构（capsequence):一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化，形成帽子结构。m7GpppNmpolyA3′5′7G“帽子”结构：5´

-末端的G被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以5´、5´

-磷酸二酯键相连。帽子结构polyA3′5′7G功能：抗核酸酶的水解；与蛋白质合成起始有关；作为mRNA与核糖体40S亚基结合的信号。1、mRNA一级结构的特点真核生物成熟mRNA的结构特点及与原核生物的区别：1）5’端帽子结构（capsequence):一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化，形成帽子结构。m7GpppNm2）3’-端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构。极大多数真核细胞mRNA在3’-末端有一段长约20—200个多聚腺苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。polyA的功能：1、与mRNA从细胞核转移到细胞质有关；2、与mRNA的半寿期有关，新合成的mRNA，polyA链较长，而衰老的mRNA，polyA链缩短mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能生物化学3)真核生物mRNA是单顺反子的，而原核生物的mRNA是多顺反子的。顺反子：是由顺反试验所规定的遗传单位相当于一个基因，含有决定一种蛋白质氨基酸序列的全部核苷酸序列。多顺反子：是指携带一种以上蛋白质合成信息的mRNA也就是说：原核生物mRNA可编码几条不同的多肽链。单顺反子：只编码一条多肽链。生物化学• mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板。• mRNA很不稳定，当它不再被用作模板时，很快就被分解。• mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（coden）mRNA的功能*

tRNA的一级结构特点含10~20%稀有碱基，如DHU3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为G

具有TC二、转运RNA的结构与功能N,N二甲基鸟嘌呤N6-异戊烯腺嘌呤双氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶

稀有碱基tRNA的三叶草型二级结构124叶子假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷环反密码子环反密码子载运氨基酸臂稀有碱基RNA中的碱基配对原则A-U G-C3额外环二氢尿嘧啶环次黄嘌呤不同的tRNA具有不同的额外环（可变环），所以额外环是tRNA分类的重要指标生物化学(1)氨基酸接受区包含有tRNA的3’-末端和5’-末端，3’-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为腺苷酸。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码区与氨基酸接受区相对，一般环中含有7个核苷酸残基，臂中含有5对碱基。其中环中正中的3个核苷酸残基称为反密码子。(3)二氢尿嘧啶区该区含有二氢尿嘧啶。环由8-12个核苷酸组成，臂由3-4对碱基组成。(4)TΨC区该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷环(TΨC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TΨC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tRNA在此环中都含有TΨC。(5)可变区位于反密码区与TΨC区之间，不同的tRNA该区变化较大，一般有3-18个核苷酸组成。二级结构模型GC

C

G

IC5´3´3´

反密码子（阅读方向3´→5´）

5´→IGC→3′

3´←CCG←5′

mRNA密码子（阅读方向5´→3´）5´*tRNA的三级结构——倒L形*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。*rRNA的结构三、核蛋白体RNA的结构与功能*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。rRNA的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环16S rRNA二级结构核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%四、其他小分子RNA及RNA组学除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。

snmRNAssnmRNAs的功能参与hnRNA和rRNA的加工和转运。核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小RNA；小片段干扰RNA

RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。RNA组学核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四节目录1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用目录二、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失目录DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。目录热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。目录Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量。（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44Tm=69.3＋0.41(G+C)%生物化学影响Tm值的因素(1)溶液的性质(2)DNA中的G-C含量大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔点温度曲线(3)DNA均一性均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围三、DNA的复性与分子杂交

DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。目录在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交(hybridization)生物化学一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性主要受三种因素的制约：1)将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时（比Tm低25℃左右最佳），可以复性。2）DNA浓度较高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。重复片段越多，复性越快。3）DNA片段的大小：DNA片段越大，复性越慢生物化学• 复性速度可用Cot1/2来衡量。• Co为变性DNA复性时的初始浓度，以mol·L-1，t为时间，以秒表示。Cot1/2的单位是mol·L-1.S• Cot1/2表示复性一半的Cot值，与速率成反比，

Cot1/2增大意味着反应速度变慢。

核酸杂交可以在液相或固相上进行。目前实验室中应用最广的是英国分子生物学家E.M.southern所发明的印迹法，称Southern印迹法（Southernblotting）。就是将凝胶上的DNA片段移到硝酸纤维素薄膜上后再进行杂交的。应用类似的方法也可分析RNA。将RNA变性后转移到纤维素薄膜上在进行杂交。这个方法称Northern印迹法（Northernblotting）。应用类似的方法。根据抗原与抗体可以结合的原理，也可分析蛋白质。这个方法称Westernblotting

下面以DNA—DNA杂交为例，介绍Southern印迹法。将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶进行电泳分离。将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA进行变性，然后将变性DNA转移到硝酸纤维素薄膜上（硝酸纤维素薄膜只吸附变性DNA），在800C烤4—6小时，使DNA牢固地吸附在纤维素膜上。然后与放射性同位素标记的变性DNA探针进行杂交。杂交须在高的盐浓度及适当的温度（一般680C）下进行数小时或十余小时，然后通过洗涤，除去未杂交上的标记物。将纤维素膜烘干后进行放射自显影。全部过程如右图。除了DNA外，RNA也可用作探针。核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础Sanger发明的末端终止法或双脱氧法Maxam和Gilbert发明的化学断裂法DNA一级结构的测定末端终止法原理：ddNTP参入可导致DNA复制的末端终止步骤：进行四组平行反应每一组反应混合物含有四种dNTP每一组反应含有一种少量的ddNTP在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。对每一组反应混合物走凝胶电泳片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部从凝胶的底部向上读出序列将读出的序列转化成互补链的序列末端终止法末端终止法图解原理：是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末端放射性同位素（32P）标记的单链DNA或者只有一条链的末端被放射性同位素标记的双链DNA片段，造成特定碱基的修饰、脱落和戊糖-磷酸骨架被特异