个体化药学服务与基因相关概念-课件

个体化药学服务与基因相关概念人类基因组计划1990年正式启动人类基因组测序计划,2003年完成。

识别人类基因组的所有大约3万个DNA测定组成人类基因组DNA的约30亿对核苷酸的序列个体化用药—主要潮流，大势所趋WHO：2000年提出，21世纪步入“3P”时代—预防（preventive），预测（predictable)和个体化（personal）美国FDA：2006全美3600万份用药记录中，880万份（24.3%）使用了说明书中有基因组生物标记信息的药物。FDA：2013.12，已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物，涉及约40%的患者。三甲评审标准要求：进行个体化给药方案的研究与监测Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我们不会愿意买只有一个尺码的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那为什么我们就满足于千人一方呢？据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率缩短平均住院日提高医院收入为临床用药提供更精确的指导（精准剂量,减少不良反应，药物相互作用等）疗效好疗效不好或无疗效毒副反应药物反应的个体差异相同药物治疗的一组人群基因?环境?药物不良反应药物效应据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性药物有效率三环类抗抑郁药50-80%阻滞药65-85%ACE抑制药70-90%5-HT1

抑制药55-80%HMGCoA还原酶抑制药70-90%干扰素30-70%抗恶性肿瘤药30-80%

药物剂量（mg）氯氮卓15-60

氯氮平25-600

奥氮平5-20普萘洛尔10-240美托洛尔12.5-200卡托普利6.25-25奈法唑酮50-300

缬沙坦80-320维拉帕米80-480利血平0.125-1相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率常用药物的有效率与剂量0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因环境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原发性高血压病冠心病I糖尿病苯妥英锂水扬酸异戊巴比妥双香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遗传和非遗传因素在药物代谢中的作用药物代谢及疾病，遗传与非遗传的影响新的医学模式:个体化治疗（PersonalizedTherapy）根据分子诊断提出治疗方案诊断分子诊断-预测反应治疗理想反应药理学+基因组学基因是载有特定生物遗传信息的DNA分子片断，人类基因包括两大区域:1.编码区(占5%);2.侧翼序列

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA专有）和尿嘧啶（U，RNA专有）碱基排列组成,每个人都存在差异，将其称为多态性。人类的基因发现几百万由单一的碱基变换而形成的位点既SNP，它意味着个人间最小的遗传差异。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鸟嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……药物相关基因研究10q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys单核苷酸多态性（SNP）导致人类遗传易感性的重要因素导致人类药物代谢和反应差异的重要因素GT突变野生型突变型变态反应药动学代谢吸收、分布、排泄药效学靶向结合作用免疫系统毒副作用治疗作用药物耐受药物代谢酶药物转运蛋白药物靶蛋白、受体人类白血球抗原药物作用基因与药物作用的关系原理基因蛋白合成举例：抗癫痫药丙戊酸钠的相关代谢酶——CYP2C19其基因最主要的两个突变位点

CYP2C19*2:第5外显子681位G→ACYP2C19*3:第4外显子636位G→A产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性CYP2C19酶，降低对丙戊酸代谢，使其在体内蓄积，发生毒副反应18...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型纯合子单核苷酸多态性形成三种基因型和表型XXXA/a野生型杂合子a/a突变纯合子高活性中活性低活性GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的剂量不同的血浆浓度P450酶活性与PD/PK值的关系吸收-慢

-快受体-缺失-丰富代谢

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-缓慢-正常药物体内过程)吸收药物代谢酶药物转运分布药物转运代谢药物代谢酶排泄药物转运药物相关基因研究CYP450

主要存在于肝微粒体中,它的活性决定药物的代谢速率,与药物的清除率有着直接关系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下几种重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。药物代谢酶根据CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量3839米帕明多虑平马普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕罗西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均剂量关于CYP2D6的表型判断举例：关于CYP2D6的表型判断，CYP2D6属于细胞色素P450酶常见药物代谢酶基因型及表型判断Β1受体基因突变药物计量调整Β1受体野生纯合子高敏感性美托洛尔25mg/次，bid100%阿替洛尔50mg/次，qd100%比索洛尔5mg/次，qd100%杂合子中度敏感性美托洛尔25mg/次，bid150%阿替洛尔50mg/次，qd150%比索洛尔5mg/次，qd150%突变纯合子低敏感性美托洛尔25mg/次，bid建议改用其他药物阿替洛尔50mg/次，qd建议改用其他药物比索洛尔5mg/次，qd建议改用其他药物

美托洛尔，根据CYP2D6基因调整剂量CYP2D6(Genotype)美托洛尔剂量调整原则PM弱代谢型心力衰竭：换药，用比索洛尔或卡维地洛。或减少75%剂量。其他适应症，警惕不良事件，如心动过缓、四肢冰冷。或换药，用阿替洛尔或比索洛尔。

IM中间代谢型心力衰竭：换药，用比索洛尔或卡维地洛。或减少50%剂量。其他适应症，警惕不良事件，如心动过缓、四肢冰冷。或换药，用阿替洛尔或比索洛尔。UM超快代谢型心力衰竭：换药，用比索洛尔或卡维地洛。或在评估疗效和副作用的前提下，可将剂量滴定到正常剂量的250%。其他适应症，换药，用阿替洛尔或比索洛尔。或在评估疗效和副作用的前提下，可将剂量滴定到正常剂量的250%。

26项目类别检测基因相关药物检测意义高血脂用药基因检测

有机阴离子转运蛋白基因(SLCO1B1)、ABCB1他汀类降脂药基因突变者降低总胆固醇作用显著减弱。硝酸甘油用药基因检测

ALDH2硝酸甘油基因突变导致硝酸甘油难以发挥有效作用。故基因有缺陷的患者，不能完全把硝酸甘油片当作救命之举。另外酒精的代谢能力也与该基因息息相关。

高血脂药物及硝酸甘油项目类别检测基因相关药物检测意义雌激素代谢酶

SULT1A1磺基转移酶雌醇类药物

该基因确实导致雌激素在卵巢等靶器官暴露值升高造成癌变。儿童智商基因

DIO2

突变儿童应补充T4基因确实可造成智商低下，切8岁后无法治愈。

雌激素与儿童智商相关基因【英国《每日邮报》网站3月23日报道】科学家发现了一种会增加儿童智商低下风险的基因。这个发现意味着，在新生儿出生后不久对其进行一项基因检测，可能会有助于发现存在上述问题的婴儿，甚至为应对这一问题确定治疗方案做好准备。科学家认识到，如果7岁以下儿童在体内出现一种常见基因变异体的同时，甲状腺激素水平也出现下降，那么他们的智商变得异常低下的可能性将为其他儿童的4倍。每年约有4%的新生儿带有这种基因，而且体内的甲状腺激素水平较低。给这些儿童服用含有甲状腺激素的药片，或许可以帮助其大脑正常发育并达到正常水平的智商。每年将会有3万名儿童因此受益。这项新研究的关注重点是与细胞内甲状腺激素的产生有关的Ⅱ型脱碘酶。研究人员此前已将这种酶的基因突变与包括糖尿病和高血压在内的其他健康问题联系在一起。在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤药物治疗的个体差异常造成肿瘤化疗的失败，且引起严重的毒副反应。个体药物治疗的药效和毒性的差异在很大程度上受到遗传因素如药物代谢酶、药物转运蛋白和药物作用靶点等药物相关基因的遗传多态性的影响。所以抗恶性肿瘤药临床有效率为30-80%肿瘤个体化治疗与基因检测根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，实现最佳的医学治疗效果。

在合适的时间(RightTime)给合适的病人(RightPatient)施行合适的治疗(RightTreatment),达到肿瘤个体化治疗肿瘤个体化治疗与基因检测肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:靶向治疗:通过实时定量、基因测序、FISH等技术检测肿瘤患者基因拷贝及基因突变信息，根据检测结果进行靶向治疗。个体化化疗：通过实时定量、基因分型、mRNA定量等技术，检测患者肿瘤标本或血液标本的mRNA表达、DNA的SNP分型，确定患者对化疗药物的敏感性和毒性反应并确定化疗剂量。肿瘤个体化治疗与基因检测类型药物检测基因相关病症适用样本判断标准基因多态性检测卡铂（碳铂、卡波铂）顺铂（顺氯氨铂，顺式铂）奥沙利铂（乐沙定、奥正南、草铂等）ABCB1XRCC1GSTP1非小细胞肺癌小细胞肺癌乳腺癌结直肠癌肝癌卵巢癌等石蜡、手术/穿刺样本、全血（抗凝）等AA基因型，出现毒副作用的风险最高，生存率降低，其次是AG型；GG型毒副作用风险最低，生存率较高。氟尿嘧啶GSTP1非小细胞肺癌小细胞肺癌乳腺癌卵巢癌等AA基因型，毒性风险最高，其次是AG型，GG型毒性风险最低。伊立替康UGT1A1*28非小细胞肺癌等TA7突变者毒副作用增加，建议降低用药量；剂量>250mg/m^2时，起始剂量减少30%。肿瘤细胞基因表达与化疗药物类型药物检测基因相关病症适用样本判断标准基因多态性检测阿那曲唑（艾达、瑞斯意、瑞婷、瑞宁得）/来曲唑（芙瑞）CYP19A1乳腺癌等全血、血浆、血清、石蜡、手术/穿刺样本等突变用药显著（纯合/杂合）伊立替康（开普拓）UGT1大肠癌等野生型纯合子用药显著SLCOIB1氟尿嘧啶DPYD直肠癌等野生纯合子用药显著5FU药物（5氟尿嘧啶等）ABCB1胃肠道乳腺癌等突变纯合用药显著乳腺癌胃癌肠癌等野生纯合用药显著顺铂（顺氯氨铂，顺式铂）奥沙利铂（乐沙定、奥正南、草铂等）ABCB1肺癌胃癌肠癌等野生纯合用药显著突变用药显著（纯合/杂合）突变用药显著（纯合/杂合）突变基因与化疗药物肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测项目类别检测基因相关药物检测意义肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测GSTM1、GSTP1、MTHFR、XRCC1、XPD、XPG、ERCC1、TPMT、CYP2E1、CYP2C9、ABCB1铂类药物：顺氯氨铂(顺铂)；草酸铂；奥沙利铂等、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤、6-硫鸟嘌呤（6-TG），6-巯基嘌呤（6-MP）、硫唑嘌呤（AZA）、环磷酰胺、长春碱、FK506、依托泊苷1.GSTM1突变型在紫杉醇和顺氯氨铂治疗后有较好的生存时间，降低急性粒系白血病治疗时的复发。2.GSTP1突变型有利患者在化疗中的生存。3.MTHFR突变的白血病患儿对于MTX的毒副反应发生风险为未突变者的11.3倍。4.XRCC1突变型对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂不敏感。5.XPG突变者用草酸铂，客观缓解率低。6.ERCC1突变型对含有铂类药物化疗的敏感性高。果因PPT工作室/guoyinppt原位杂交技术

2014-03-19原位杂交技术一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用一、原位杂交技术的历史发展

原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。原位杂交法分类1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。

2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性

原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放

射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记

的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切

片上的特异性杂交，通过荧光检测系

统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或

DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂

交位点。3、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧

光原位杂交技术的基础上发展起来的

一种新技术，它用几种不同颜色的荧

光素单独或混合标记的探针进行原位

杂交，能同时检测多个靶位，各靶位

在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，

呈现多种色彩。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位杂交法分类三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测探针标记靶核酸分子杂交检测一）、探针

是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸1、cDNA(complementaryDNA)互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）⑴克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽⑵较稳定，不易被降解⑶标记方法可靠易行优点优点：⑴杂交效率比DNA探针高

⑵在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定

⑶可以同时得到同义RNA链和反义RNA链缺点：2、RNA

RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）容易受RNA酶的污染而被降解

这类探针是根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上用化学方法合成

优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）

缺点：特异性较低（短链和简单）短链探针(长度10-50个核苷酸)3、寡核苷酸

二）、探针标记1、标记物

（1）放射性标记物

（2）非放射性标记物2、标记方法

（1）DNA探针标记

（2）RNA探针标记

（3）寡核苷酸探针标记

1、标记物①高度灵敏性；②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④高度特异性；⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损伤；⑦价格低廉等。标记物分类放射性标记物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性标记物：荧光素生物素地高辛

溴脱氧尿嘧啶等标记分子：某种单核苷酸在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响标记分子：放射性标记分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性标记分子：

四甲基罗达明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子2、标记方法（1）DNA探针标记

切口移位法随机引物法（2）RNA探针标记

在体外转录技术中与探针制备同时完成（3）寡核苷酸探针标记

末端转移法将放射性或非放射性的标记分子在各种酶促反应中参入探针分子切口平移法随机引物法

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色体上的或是间期细胞核内的，也可以是线粒体DNA或病毒DNARNA——可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子的mRNA，也可以是核糖体rRNA线粒体或病毒RNA四）、杂交

1.杂交体

2.杂交条件

3.严格度的概念1、杂交体hybrids

DNA-DNADNA-RNARNA-RNA稳定性依次是：DNA-DNA＜DNA-RNA＜RNA-RNADNA-DNA杂交双链分子变性复性2、杂交条件（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间（1）、杂交液

①钠盐（杂交效率↑非特异反应↓）②甲酰胺（使杂交所需温度降低裂解红细胞）

③硫酸葡聚糖（提高探针浓度）

④牛血清白蛋白和载体DNA等（阻断探针与组织非特异结合，↓背景）杂交条件

（2）、探针浓度

探针浓度影响杂交反应的速度

放射性标记探针0.5μg/ml非放射性为2μg/ml最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件（3）、温度杂交时温度一般低于相应杂交体的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）

当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时杂交温度：对DNA探针是42℃