T-SDAA 0050-2021 猪丹毒丝菌的检测 PCR法

ICS65.020.30B43团体标准T/SDAA0050－2021猪毒丝的检测 PCR法DetectionofErysipelothrixrhusiopathiaebyPCR2021－11－30发布 2021－12－31实施山东省畜牧协会 发布T/SDAA0050－2021T/SDAA0050－2021前  言本文件按照GB/T1.1—2020的规定起草。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本规范起草单位：青岛农业大学、青岛农业大学海都学院。本规范主要起草人：韩先杰、高善颂、陈甫、邱慧玲。本文件为首次发布。T/SDAA0050－2021T/SDAA0050－2021猪丹毒丝菌的检测 PCR法范围本文件规定了猪丹毒丝菌的PCR检测方法。本方法适用于猪丹毒丝菌的检测。规范性引用文件（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T566-2019猪丹毒诊断技术原理DNA核酸为DNADNADNA条带的大小来判断结果。试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。水：GB/T6682，一级。5%绵羊鲜血平板革兰氏染液2×TaqMasterMixDNAMarkerDL2000琼脂糖TAE缓冲液4SGreenPlus无毒核酸染料T/SDAA0050-2021仪器设备生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。高速冷冻离心机：转速不低于12000rpm/min。PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pgEB染色的双链DNA。紫外透射仪：透射紫外光源波长为302nm。3～300V1～400mA1～120W。样品按照NY/T541的规定采集、贮存样品。试验步骤细菌的分离及纯培养24h~48h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。猪丹毒丝菌形成圆形、灰白色、针头大小的菌落，且边缘有狭窄的α溶血环，菌落形A.1。革兰氏染色与镜检1cm大小的水膜。挑取单个菌落均匀涂抹在水膜内，室温干燥、火焰固定。随后进行革兰氏染色。1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥；1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥；95%10s-30s，流水缓慢冲洗，干燥；1min，流水缓慢冲洗，自然干燥。T/SDAA0050-2021显微镜观察细菌形态。V字形、堆状或短链排列附录A.2。PCRDNA模板的制备参照NY/T566中4.2.4.4规定制备。PCR扩增引物根据猪丹毒丝菌的特异基因序列（附录A.3，设计一对引物，商业合成，引物序列见B.1。PCR反应体系PCR反应体系为25µL体系，见附录B.2。PCR反应条件2000rpmn离心1inRCR5min，9430s，52.530s，7230s32个循环，72℃终10min（标准株（无菌水PCR1.0%DNA条带的大小。琼脂糖凝胶电泳按NY/T566-2019 4.2.4.6规定执行。结果判定成立条件DL2000DNAMarkerDNA377bp（.3。阳性判定符合7.5.1的条件下，被检样品扩增出约377bp的片段，则判定被检细菌为猪丹毒丝菌附录.3。T/SDAA0050-2021阴性判定7.5.1377bp的片段，则判定被检细菌不是猪丹毒丝菌。T/SDAA0050－2021附录A（资料性）猪丹毒丝菌的菌落形态（A.1）图A.1 猪丹毒丝菌的菌落形态（绵羊鲜血平板

T/SDAA0050-2021猪丹毒丝菌的形态（A.2）图A.2 猪丹毒丝菌的形态（革兰氏染色）T/SDAA0050－2021L基因序列（图A.3）AAAGAACTTGGAATGAACATCAAAGAAACTGAAATCGATCAACTTGGAACGGCTTCAAAAGTAGTCATCCGCAAGGACGAAACAACCTTAATTGGTGGAGCTGGAACCAAAGAGGCCATTGAAGAACGTGCAAGTGAAATTCGTTCTCAAATAAACAATGTAAGCAGCGACTTTGATAAGAAAAAACTTGAAGAACGTCTTGCGAAACTTACAAATGGTGTTGCTGTCATTAAAGTTGGAGCAGCAACTGAATCCGAAATGAAAGAGAAAAAACTACGCATTGAAGATGCACTCAACGCAACCAAAGCTGCGGTTGCAGAAGGTGTCGTGCTTGGTGGTGGATATGCCCTTGCTCGTGCCTACATGGATCTAAAAGATAACCTAAGTTCAGAAAATCAAGACGAAAATAGAGGTATTAAAACCGTCTTTGAATCAATCCTAAAACCACTCTGGCAAATAGCTGAAAATGCCGGATTTGATGGAGACGAAATCGTTACAAA图A.3 设计引物的参考序列

上游引物下游引物T/SDAA0050－2021附录B（规范性）PCR（表B.1）表B.1PCR扩增的引物序列引物名称引物序列（5＇-3＇方向）扩增片段大小上游引物（F）5′-GACAACCTTAATTGGTGGAG-3′377bp下游引物（R）5′-TTTGCCAGAGTGGTTTTAGG-3PCR（表B.2）表B.2 PCR扩增体系（25μL）组分体积（μL）2×TaqMasterMix上游引物12.51.0下游引物1.0DNA模板1.0无菌H2O9.5PCR（B.3）