《对具有促生抑病功能的真菌快速筛选方法的初步研究【4200字】》

对具有促生抑病功能的真菌快速筛选方法的初步研究目录TOC\o"1-2"\h\u18730对具有促生抑病功能的真菌快速筛选方法的初步研究 174681引言 160042对不同促生抑病功能真菌的快速筛选研究 120842.1拮抗病原菌的筛选 141442.2芽孢杆菌的筛选 2162922.3地衣真菌的筛选 263152.4西瓜枯萎病生防细菌YZU-S8的筛选 2237742.5草莓拮抗真菌的筛选 3210203总结 424012参考文献 4摘要：农作物出现病变会在很大程度上引起产量降低问题，现阶段的农业种植过程中农民仍然对庄稼施加农药化肥来实现控制病变的目的，提高农作物产量。然而，农药会给植株和环境带来污染问题，使植株产生抗药性，甚至影响其他作物生长。因此，本文将以防病增产多功能微生物产品为最终目标，本着对具有促生抑病功能的真菌快速筛选方法的初步研究加以分析研究，通过搜集学术期刊的相关参考文献对其加以论述分析，旨在一套较为快捷的筛选方法，更好的改善植物病害的生物防治措施，从而对生物工程的相关研究进展提供一定的参考与借鉴。关键词：促生抑病，真菌，快速筛选，研究现状1引言植物赖以生长的土地环境和植株自身都能提取加工得到抑制病变的细菌，这些细菌能够有效的防治农作物等植物继续受到病变蚕食。考虑到植物根系细菌群落的组成和多样性受多种因素的影响，如根系密度、分泌物等。在农业生产中，类似芽孢杆菌这样的细菌在防病的稳定性、与化学农药的相容性等方面，都表现出非芽孢细菌所没有的优势。因此，生物防治细菌的筛选对农业生物防治极其重要。而前文提及的如根系密度、分泌物等因素，又受到植物根内生细菌群落的组成和多样性受的影响。因此相关学者在研究结果中表明不同作物根内生细菌群落组成不同，从正常植株根内分离的大部分细菌具有根内生长和根际生长的两个特征。在综合疾病管理框架内，使用具有生物控制活性的根内生菌对土壤传播的植物病害具有环境友好和生态高效的作用。此外，考虑到部分细菌由于具有促生和生防功能，并可增强寄主植物抗逆境等生物学特性，所以植物内生细菌的研究具有一定的价值。据此，本文将对植物的真菌快速筛选方法进行初步的研究。2对不同促生抑病功能真菌的快速筛选研究2.1拮抗病原菌的筛选有文献从168株植物体内分离筛选的对黄瓜枯萎或番茄青桔病菌有抑制能力的细菌中得到能够有效灭活辣椒疫病菌的菌体19株，用三明治法对其加以研究发现，这19株菌体能够实现38%-95%的病变抑制，效果最明显的是一种叫做TB2的菌种，抑菌率95%，其他菌体的抑菌效果远不如TB2。研究人员同时利用这19种菌体对黄瓜枯萎病菌展开实验，发现其拮抗作用也非常明显，约45%-86%。将这两组实验数据进行对比分析发现，能够抑制黄瓜枯萎病菌的生防菌大多能够很好的控制辣椒疫病菌。除上述发现以外，实验还从另一方面表明，生防菌的普遍拮抗作用说明植物体内自身存在的菌种对防治植物病变存在显著作用。该筛选方法获得的内生拮抗菌，从试验结果看其防病效果与内生性具有一定的相关，其中防病效果最佳的菌株，在植物体内的内生定殖能力也最强，但是，这种在植物体内生存的细菌能否稳定存在于外界环境，以及生防菌是通过何种作用原理实现病变抑制等问题，依旧是目前学术上研究的重要课题。2.2芽孢杆菌的筛选对于植物病害生防芽孢杆菌的的实验研究已经相对成熟，并在植物生长过程中得到了一定程度的应用，但也存在一定的局限性。比如说，能够实现抑制作用的菌体品种少，抑制作用不甚稳定等。国际上主要致力于PGPR类制剂的研究，一般适用于生物防治。而且，研究人员的研究方向并没有针对芽孢杆菌深入展开，而是偏向于单一功能生物因子或同一功能的不同生物因子的功能菌群J。特别需要注意的是，基本没有对多功能芽孢菌株筛选或功能芽孢菌株的复配组合的实验探究。综合考虑上述原因，有研究以芽孢杆菌的抑病、促生、活化养分及改善微生物区系四个角度为入手点，通过皿内拮抗试验、盆栽促生试验及土壤养分和微生物类群的测定，发现7株具有多重功效的复合芽孢杆菌，并得到功能组合B04-B06-B07和B01-B04-B07，使微生物菌群在组成和功能上逐渐由单一走向多元化成为可能，为复合生物肥料的研发和生产提供了理论指导，对生物农业的快速发展具有重大意义。2.3地衣真菌的筛选首先，是降解纤维素、溶解无机磷真菌的初筛以点接的方式将120株地衣真菌菌株分别接种到刚果红培养基和PKO培养基上，在25℃恒温培养箱中培养3-4d，观察结果。根据水解圈直径与菌落直径的比值（D/d）大小初步确定该菌株降解纤维素能力和溶磷能力的强弱，筛选出比值较大的菌株作为后期复筛的菌株。其次，是降解纤维素、溶解无机磷真菌的复筛绘制标准工作曲线：配制葡萄糖标准液，以DNS法测定还原糖含量。以吸光度值为横坐标，葡萄糖含量（mg/mL）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。使用已配置好的磷标准液，测定吸光值绘制磷标准溶液曲线，具体操作参见文献。功能活性的测定：菌株液体培养发酵得到粗酶液。采用滤纸酶活测定法，测定降解纤维素真菌的滤纸酶活力；采用钼锑抗比色法测定溶磷真菌的酶活力；用紫外可见分光光度计测定吸光值，由吸光值在标准曲线中找到对应的葡萄糖和磷含量，根据公式计算出酶活力。然后，是进行抗病原菌真菌的筛选采用平板对峙法测定抑菌活性。将前期初筛获得的溶解无机磷、降解纤维素的地衣真菌发酵液采用打孔法接在PDA平板中央，四周接上少量供试病原菌尖孢镰刀菌、花生茎点霉、苹果轮纹菌。设置空白对照，每个真菌做3个重复。25℃恒温培养3-4d，观察病原菌生长状况。最后，是确定最佳组合挑选高效降解纤维素菌株、溶磷菌株、抑菌菌株，结合菌株生长曲线确定菌种比例，进行滤纸崩解实验，筛选最佳降解纤维素组合，采用钼锑抗比色法筛选最佳溶磷组合。2.4西瓜枯萎病生防细菌YZU-S8的筛选首先，是采用平板对峙法对西瓜枯萎病拮抗菌株进行初筛，然后再对西瓜枯萎病拮抗菌株进行复筛，具体步骤是将初筛的菌株分别接种于NB中，于28℃，130r/min的摇床上培养48h。在PDA平板中央接种培养72h的西瓜枯萎病菌菌饼(直径6mm)，用无菌的打孔器在距离中央2cm处三点对称打孔，每孔中分别注人100μL待测菌株的菌液，以接种等体积的NB为对照，每个处理3次重复，平板置于28℃恒温培养箱中培养，待对照平板中西瓜枯萎病菌菌丝即将长满全皿时，测量各处理组的抑菌带大小。最后，对菌株YZU-S8抑菌谱进行测定，该方法是通过制备YZU-S8的无菌滤液，将无菌滤液混人冷却至55℃左右的PDA中，使其终浓度分别为5%，10%和20%，倒成平板。以混人相同体积的NB为对照。在PDA平板中央接入待测病原菌菌饼，28℃倒置培养。每处理4次重复。待对照组菌丝几乎长满培养皿时，测量各组的菌落直径，计算相对抑制率。整体而言，该方法是从油菜根和根际分离筛选出一株对西瓜枯萎病菌具有显著抑制活性的内生菌株YZU-S8，经鉴定为贝莱斯芽抱杆菌。YZU-S8的无菌滤液对病原真菌表现出了广谱的抑制作用，表明其可产生具有抑菌效果的活性代谢产物。然而，该菌株能合成的抑菌物质的成分尚不明确，需要进一步研究。2.5草莓拮抗真菌的筛选将温室草暮苗挖出，用小铲抖去根系周围的附着土壤，装入无菌自封袋内带回实验室。在自封袋外用手轻揉根系使其表而附着较紧密的土壤落入袋内作为根区待测土壤，称取此土样10.00g加入装有玻璃珠的90mL无菌水二角瓶内，常温卜160r/min震荡20min混匀，制得根区土壤悬液；再将自封袋内根系取出，称重后放入装有玻璃珠的100mL无菌水瓶中，常温卜160r/min震荡20min，将根系表而土壤洗入无菌水中，制得根表土壤悬液；最后将根取出，用吸水纸吸干根系表而游离水分，称取0.50g须根样品，在70%酒精溶液中浸泡20s，再放入1g/L升汞处理30s杀死须根表而微生物，用无菌水冲洗5次去除残余升汞，用无菌滤纸吸干表而水分置于无菌研钵内，加5mL无菌水研磨匀浆，即为根系待测样品。用稀释平IIII一涂抹分离法对供试样品中的真菌进行分离，分离培养基为PDA。通过形态特征对分离菌初步鉴定并计数，计算不同种类真菌占分离真菌总数的比例。通过草莓根腐病株与健株的真菌区系比较，找出健株特有且在数量上占优势，而病株根区、根表土壤中不存在或数量很少的真菌。在同一生态条件下，草莓根腐病是否发生与草莓根区、根表土壤中的真菌区系及优势真菌有密切关系，故健株根区土壤中特有真菌在理论上具有抗病性。整体而言，该方法是通过对草莓田间生态现象进行的详细观察，通过草莓健株、病株根域土壤微生物区系比较分析，寻找到健株根区特有而病株根区不存在或数量很少，能保持健株不发病的优势真菌，并通过进一步研究证明了健株根区、根表土壤的2株优势真菌的抗病及促生活性。故而，该思路是基于土壤微生态基本原理，通过病健株微生物区系的比较分析，锁定健株中不同于病株的几种优势真菌，与传统的以病田健株根域的大量微生物为筛选对象的“海选”策略相比，工作量大幅度减少，筛选效率大幅提高。其次，用此筛选程序获得的生防菌来自健株根域土壤，该菌株的实际防效已获得了田间生态条件适宜性检验，在生产上的生防效果会优于其它方法筛选所得菌株，克服了其它方法获得的入选菌株室内效果好，而田间防效较差的问题，减少了用其它筛选策略获得的菌株进行大田适应性研究耗费的时间，是一条效率相对较高的筛选途径。通过本次综述可知，该研究为草莓根腐病拮抗真菌的快速分离筛选及分离源采集提供了理性化的新思路，也为生防细菌及放线菌的筛选思路设计提供了重要参考。3总结一般而言，微生物间共同联系产生的效果得源于其具备产生抗体的能力。为了可以提升对具有促生抑病功能的真菌进行快速的筛选，一直都是当下不少研究人员论述与探讨的重要话题之一。而本次在基于相关参考文献的基础上，对部分具有促生抑病功能的真菌进行了快速筛选的方法论述，以期可以为我国农业在今后的发展过程中，起到效率高，操作简单，结果可靠的目的，从而促进微生物筛选抗真菌资源的工作效率，并为当下致力于简化已有相关测定技术提供一定的参考与借鉴。参考文献[1]韩如月,李睿瑞,杨帆,等.一株水稻根内生拮抗细菌SM13的分离及鉴定[J].微生物学通报,2019,46(005):1030-1040.[2]郑通文、蔡民政、刘璐、孙正祥、周燚.西瓜枯萎病生防细菌YZU-S8的筛选及其防病促生作用的研究[J].江西农业大学学报,2020,v.42;No.224(06):36-43.[3]徐萌.野大豆内生真菌YD-25的筛选鉴定及促生,抗重金属活性研究[D].沈阳师范大学,2019.[4]韩如月.水稻根内促生拮抗细菌的筛选及其性能评价[D].2019.[5]张翠绵,贾楠,马佳,等.番茄根际多功能益生芽孢杆菌的筛