TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌

TaqManMGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌高正琴;岳秉飞;贺争鸣TaqManMGBPCRHPcagATaqManMGBPCR对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠12011002.2×101copies/μLDNA.标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X38.633,相关系数0.999,扩100.648％.批内相对标准偏差(RSD0.19～1.2％RSD3.4％,RSD51201HP1302HPGenBankHP99％～100TaqManMGBPCRHP【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2012(030)007【总页数】3页(P500-502)【关键词】幽门螺杆菌;小沟结合物探针;实时荧光定量PCR;检测【作者】高正琴;岳秉飞;贺争鸣【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京100050【正文语种】中文【中图分类】R446.5幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，HP)是慢性胃炎、消化性溃疡及胃肠道淋巴瘤的主要致病因素，与胃癌发生密切相关［1］。国际癌症研究中心把HP定为Ⅰ类致癌因子［2］。目前，国内外尚未见用TaqMan小沟结合物(minorgroovebinder，MGB)探针实时荧光定量PCR法检测HP的研究报道。本研究利用新一代TaqManMGB探针技术，建立了一种检测HP的实时荧光定量PCR方法，并成功用于临床标本中HP的快速检测，报道如下。材料与方法2008～20116944196［3-4］3个品系)由国家实验用小型猪种质资源基地提供，活体心脏采集全血标本，麻醉处死采集肠;金黄地鼠由四川成都生物制品研究所提供;猴(恒河猴、食蟹猴)、犬(比格犬)、兔(新西兰、大耳白、青紫蓝)、豚鼠(Hartley)、大鼠(Wistar、SD、BN、F344)、小鼠(KM、ICR、、BALB/c、SCID、裸鼠、C3H、TA1、C57BL/6、T739、DBA/2、N2221。HPNCTC11637、HP1(Sydneystrain1，SS1)、肝螺杆菌(Helicobacterhepaticus/毛样梭菌(Clostridiumpiliforme)由本实验室保存;小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、肠炎沙门菌(Salmonellaenterica)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由中国医学细菌保藏管理中心提供;空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)购自美国标准菌种收藏所;含有HPcagA基因的标准质粒由本实验室构建并保存［5］，质粒浓度为2.2×1011copies/μL。HP210g/Lwater)、TaqManmixABIDNADNAPCRABIHPHP考文献［6］分离鉴定。DNA提取按细菌基因组DNAHPNCTC11637、HPSS1、肝螺杆菌、空肠弯曲杆菌、毛样梭菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的DNA。按通用型基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取肝癌、肝硬化患者腹水及全血和小型猪、猴、犬、兔、金黄地鼠、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠标本的DNA。标本均－70℃保存。GenBankHPcagA(NM_GQ161098.1)PrimerPremier5.0:5'-CTGGAGCTAGGCATGATTGGA-3';反向引物:5'-CACATTGTTGCCTTGTTGGTCTTT-3';探针:FAM-ACGGTGGCGTTCCAATCA-NFQ-MGB62bpABITaqManMGBPCR20μL，包括正、反向引物(各900nmol/L)和探针(250nmol/L)共1μL、TaqManmix10μL、模板DNA1μL、无核酸酶水8μL。循环参数:95℃20s;95℃3s，60℃30min，共40个循环。用仪器自带SDS软件实时分析PCR荧光扩增曲线并采集数据。DNAMGB探针实时荧光定量PCR检测，并进行常规细菌分离鉴定。部分阳性样本送大连宝生物公司进行测序鉴定。实验与结果HPNCTC11637、HPSS1MGBPCRHPNCTC11637、HPSS1Ct30;而肝螺杆菌、毛样NTCCt100%。HP(2.2×1011copies/μL)10同浓度的标准质粒(2.2×101～2.2×109copies/μL)1μLTaqManMGB探针实时荧光定量PCR检测，分析该法的灵敏度，实验重复3次。结果显示，本法最低可检测2.2×101copies/μLDNA。CtY=－3.306X+38.6330.999，扩增效率为100.648%。HP(2.2×103～2.2×107copies/μL)连3d33Ct准偏差(relativestandarddeviation，RSD)验证该方法的重复性。结果表明，批内RSD为0.19%～1.2%，批间RSD为0.14%～3.4%，RSD均＜5%，提示该法重复性良好。HP1201出130份(10.8%)HP阳性，见表1。常规细菌分离法仅检出2份(0.17%)HP阳性。阳性样本测序与GenBank中收录HP序列同源性为99%～100%。12008～2011TaqManMGBPCR1201HP/20081/108/192/253/69/4521/10017/11210/7020/1120/90/3020114/9420090/1021/2105/441/451/102/901/404/120201讨论TaqManMGBPCRHPDNAPCR毛样梭菌、空肠弯曲菌与HP间易出现血清学交叉反应，用本研究建立的TaqManMGBPCRHPHPHP”(viablenonculturable，VNC)，故常规分离时可能会漏检。一般分离培养所需标本中的菌量大，但在腹水、血液等标本中，细菌量多不超过1.0×103CFU/μL，常规分离培养法难以测出。而本研究建立的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR法灵敏度高，最低可检测相当于22个拷贝的DNA样本。在1201份患者和多种动物腹水、全血、粪、肠标2HP130P＜0.01)。原因可能是因为常规分离培养只能检测到活菌，而HP有可能在病例采集、处理及保存过程中失活，但其DNATaqManMGB3'端标记了自身不发光的猝灭分子，以取代常规可发光的四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光标记物，这使荧光本底降低，荧光光谱分辨率大大改善。二是探针3'端增加了一个MGB，可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度。一方面缩短了探针长度，使荧光基团和猝灭基团的距离更近，猝灭效果更好。另一方面，也提高了探针的特异性，使结果更精确，分辨率更高［7］。因此，用TaqManMGB探针实时荧光定量PCR进行HP感染监测，可及时发现并阻断中间污染环节，有利于预防和控制HP所致疾病的发生。综上所述，本研究用TaqManMGB探针荧光定量PCR技术，实现了对HP的定量分析，并将此法成功地应用于各种标本中HP的检测。建立的方法具有准确、可靠、快速检测的特点，可应用于食品药品安全检验，临床标本检测，环境监测，流行病学调查等诸多领域。参考文献［1］CorreaP，PiazueloMB.Helicobacterpyloriinfectionandgastricadenocarcinoma［J］.USGastroenterolHepatolRev，2011，7(1):59-64.［2］AntonodimitrakisP，TsolakisA，WelinS，etal.GastriccarcinoidinapatientinfectedwithHelicobacterpylori:Anewentity?［J］.WorldJGastroenterol，2011，17(25):3066-3068.［3］中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南［J］.肝脏，2005，10(4):348-357.［4］中国抗癌协会肝癌专业委员会.原发性肝癌诊断标准［J］.中华肝脏病杂志，2000，8(3):135.［5］高正琴，岳秉飞，贺争鸣.布鲁菌和幽门螺杆菌等6种病原菌16SrRNA和cagA等基因的克隆与鉴定［J］.中国人兽共患病学报，2010，26(8):715-719.［6］高正琴，张强，岳秉飞，等.贵州小型猪幽门螺杆菌的分离及其鉴定［J］.实验