段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用

免疫磁珠分离技术（IMB）

及在食品生产中的应用

段旭昌副教授西北农林科技大学食品科学与工程学院2013910提纲磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球的制备磁性微球分离技术免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁株的特点免疫磁珠的分类免疫磁珠的制备免疫磁珠分离技术免疫磁珠技术的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术的优缺点及发展望一磁性微球是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。高分子磁性微球表面具有众多表面功能基团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。二磁性微球结构、分类及特点磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、铁钴合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4应用最多。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。磁性微球表面可根据需要赋予不同的功能基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。导电聚合磁微球聚合磁微球对磁性微球的要求：粒径均匀、大小合适、比表面积大、吸附力强、具有强的超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、表面具有多种活性基团、理化性质稳定、具有较好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。由于环氧基、氯甲基功能基团非常活跃，不需连接其他活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。三磁性微球的制备

磁性微球制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。1.共沉淀法

金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球的方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先通过单体聚合反应得到PS-AAEM颗粒分散剂，再把配制好的Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）颗粒的分散剂中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉积，制得PS-AAEM为核心、Fe3O4粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变FeCl2和FeCl3的浓度或改变PS-AAEM核心的尺寸来控制。Xia等把一定配比的FeCl2、FeCl3与葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超声连续作用下水浴加热，制得以Fe3O4为核、dextran为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O与配体（如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）组成的混合液体加入到75℃的葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核的磁性微球。2聚合法制备磁性微球过程异相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用表面改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体的溶剂中进行聚合反应。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。四磁性微球分离技术MACS(MagneticActivatedCellSorting)

是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体，利用磁性微球表面功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以分离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型分离技术，具有广泛的用途。

几种DNA

分离方法的比较ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法DNA提取酚/氯仿等溶剂抽提Chelex100树脂吸附玻璃粉吸附离心分离磁珠吸附磁场分离抗原抗体反应磁场分离适用范围大多数标本DNA提取纯化培养及各种临床标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标本方法评价DNA纯度高、含量多，但较费时，步骤繁琐，用有机溶剂，有损操作者健康。可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸的提取。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能彻底除去PCR抑制剂。简单、快速，整个过程不到2h，可获得较纯DNA。适于少量样本。DNA纯度高，含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗体的制备是关键。五免免疫磁磁珠免疫磁磁珠（（IMB）也称称免疫疫磁性性微球球，是是在磁磁性微微球表表面偶偶联上上免疫疫配基基的一一种磁磁性微微球，，是将将磁性性微球球技术术和免免疫学学相结结合的的特殊殊磁性性微球球。六免免疫磁磁珠的的结构构与性性质免疫磁磁珠核核心为为顺磁磁性粒粒子，，核心心外层层包裹裹一层层高分分子材材料，，最最外层层是免免疫配配基。。免疫配配基免疫配配基通通过生生物高高分子子的功功能基基团结结合到到磁性性载体体微球球上形形成免免疫磁磁珠。。由于于载体体微球球制备备材料料和方方法不不同，，其表表现出出的物物理性性质也也不同同，从从而而可结结合不不同的的免疫疫配基基，如如抗抗原、、抗体体、凝凝集素素、DNA和RNA等。配配基必必须具具有生生物专专一性性的特特点，，而而且载载体微微球与与配基基结合合要不不影响响或改改变配配基原原有的的生物物学特特性，，保保证磁磁珠的的特殊殊识别别功能能。免疫磁磁珠的的性质质具有均均匀性性、超超顺磁磁性及及保护护性外外壳，，由磁磁性载载体微微球和和免疫疫配基基结合合而成成，表表面具具有专专一亲亲和性性和吸吸附作作用。。免疫磁磁珠大大小和和形状状具有有均一一性，，可可使靶靶物质质迅速速有效效地结结合到到磁珠珠上，，可使使新生生成复复合物物在磁磁场中中具有有相同同磁响响应性性，且且行为为一致致。磁珠球球形结结构可可消除除与不不规则则形状状粒子子间的的非特特异性性结合合，顺顺磁性性可使使磁珠珠置于于磁场场时显显示其其磁性性，并并做定定向移移动，，从从磁场场移出出时磁磁性消消除，，磁磁珠分分散，，可可方便便地进进行分分离和和磁性性导向向。保护性性壳可可防止止磁性性内核核漏出出或被被载液液腐蚀蚀；免疫配配基可可专一一性结结合反反应体体系中中相应应的抗抗原、、抗体体、核核酸等等生物物活性性物质质。七免免疫磁磁株的的特点点磁性微微球与与免疫疫配基基结合合牢固固。不影响响或改改变免免疫配配基原原有的的生物物特性性和特特异性性。免疫微微球的的识别别专一一性。。在磁场场中具具有顺顺磁性性，离离开磁磁场磁磁性消消失，，易于于分散散。由于聚聚苯乙乙烯磁磁性微微球强强度高高、表表面易易进行行化学学维修修饰，，是比比较理理性的的制造造免疫疫磁珠珠的材材料。。八免免疫磁磁珠的的分类类根据磁磁珠在在磁场场中受受力大大小及及磁珠珠体积积，分分为小小磁珠珠和大大磁珠珠。大磁珠珠：1-5um，粒径径较大大、悬悬浮稳稳定性性差、、易沉沉淀、、比表表面积积小、、吸附附能力力低、、吸附附活性性配基基少、、对细细胞影影响大大，特特别是是阳性性分选选时需需将磁磁珠与与细胞胞解离离后方方可进进行下下一步步实验验。但但磁力力强，，无需需特殊殊分离离柱即即可实实现样样品分分离，，分离离速度度快、、过程程简单单、成成本低低。小磁珠珠：50nm以下，，粒径径较小小、悬悬浮稳稳定、、比表表面积积大、、表面面吸附附活性性配基基多，，只有有细胞胞体积积的万万分之之一，，对细细胞表表型和和功能能影响响小，，不影影响细细胞的的后续续培养养。但但磁力力弱，，需特特殊分分离柱柱才能能实现现样品品分离离，分分离速速度慢慢，成成本高高九免免疫磁磁珠的的制备备免疫磁磁珠的的制备备是将将磁性性微球球和抗抗体等等配基基结合合而成成。磁磁性微微球与与抗体体的连连接方方式有有共价价结合合和吸吸附结结合两两种方方式。。共价结结合：：依靠磁磁珠表表面的的活性性基团团如-CHO、-COOH等与抗抗体Fab段上的的-NH2共价反反应和和结合合吸附结结合：：依靠磁磁珠巨巨大的的比表表面与与抗体体见得得非特特异性性吸附附而结结合。。共价结结合的的牢固固度远远远大大于吸吸附结结合牢牢固度度。制备方方法：：先制备备磁性性微球球，然然后将将磁性性微球球分散散于抗抗体配配机溶溶液中中使磁磁珠与与抗体体充分分吸附附结合合，然然后分分离免免疫磁磁珠分分散于于缓冲冲溶液液中可可以使使用。。十免免疫磁磁珠分分离技技术免疫磁磁珠(immunomagneticbead,IMB)分离技技术：：是一种种以特特异的的抗原原抗体体反应应为基基础的的免疫疫学磁磁性微微球检检测和和分离离技术术。它它是以以抗体体包被被的微微球磁磁珠为为载体体，通通过抗抗体与与反应应介质质中特特异性性抗原原结合合，形形成抗抗原—抗体复复合物物，此此复合合物在在外加加磁场场作用用下发发生定定向移移动，，从而而达到到分离离抗原原的目目的。。基本原原理：：磁性性微球球经过过一定定处理理后,将抗体体结合合到磁磁珠上上,形成免免疫磁磁性微微球（（标记记磁珠珠）,标记磁磁珠的的抗体体与特特异性性抗原原结合合形成成抗原原—微球复复合物物,该复合合物在在磁场场中具具有与与其它它组分分不同同的磁磁响应应性,在磁力力作用用下,该复合合物发发生力力学移移动,从而达达到分分离抗抗原的的目的的。以细胞胞分离离为例例图解解免疫疫磁珠珠技术术的原原理免疫磁磁珠标标记方方法1直接磁磁珠和和直接接标记记法通过物物理吸吸附和和共价价键结结合直直接将将特意意性抗抗体与与磁珠珠耦合合，然然后再再与相相应细细胞结结合，，形成成细胞胞-抗原-抗体-磁珠复复合物物，在在外磁磁场下下直接接分离离目的的细胞胞。快快速、、简单单、特特异性性和细细胞得得率高高，灵灵敏度度低，，需制制备相相应的的偶联联抗体体磁珠珠。2简介磁磁珠和和间接接标记记法使用anti-lg等与磁磁珠偶偶联，，通过过Anti-lg再使磁磁珠与与二抗抗体偶偶联，，分离离细胞胞时，，先使使细胞胞与一一抗特特异性性结合合，然然后在在与一一抗标标记磁磁珠结结合，，形成成细胞胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体体，在外磁磁场下分离离目的细胞胞的方法。。该法增加加了细胞的的洗涤步骤骤，特异性性也会降低低。该法一一般用于①①没有直标标磁珠抗体体②需用几几种抗体去去除多种细细胞③目的的细胞上特特异性抗原原分子表达达水平低。。MACS微珠直标微珠多选微珠间标微珠免疫磁珠分分选方法阳性分选：：运用特异性性抗体偶联联磁珠直接接从细胞混混合物中分分离目的细细胞的分选选方法称为为positiveselection.阳性分选中中磁珠标记记的细胞即即为目的细细胞。该法法简单、快快速、细胞胞得率和纯纯度较高。。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。。阴性分选：：用抗体偶联联磁珠去除除无关细胞胞，使目的的细胞得以以纯化和分分离的分选选方法称为为negativeselection.阴性分选中中磁珠标记记的细胞为为非目的细细胞。如分分离CD4+T细胞时，由由于没有专专用的CD4+T细胞分选磁磁珠，可通通过anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119标记磁珠去去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬噬细胞、粒粒细胞等，，最终而获获得较纯的的CD4+T细胞。因此此阴性分选选法适用于于：①从细细胞混合物物中去除某某种类型细细胞。如肿肿瘤细胞。。②缺乏针针对目的细细胞筛选的的特异性抗抗体磁珠时时。③抗体体和目的细细胞结合可可能诱导细细胞活化，，影响后续续细胞功能能分析时。。复合分选：：将阴性分选选和阳性分分选相结合合的分选方方法。当目目的细胞含含量特别低低，无法直直接进行阳阳性分选时时，可采用用阴性分选选发先出去去其他杂细细胞，当目目的细胞富富集到一定定程度时在在采用阳性性分选发筛筛选目的细细胞。免疫磁珠与与细胞解离离1过夜培养法法：常用方法。。将结合磁磁珠细胞置置于10%胎牛血清培培养基中37℃5%CO2细胞培养箱箱中培养16-24h，磁珠可从从细胞上脱脱落，再通通过磁场除除去游离磁磁珠，即可可获得裸细细胞。2anti-Fab抗体法：用anti-Fab抗体与磁珠珠偶联抗体体竞争目的的细胞，是是磁珠与目目的细胞解解离，用磁磁场除去游游离磁珠，，即可获得得非标记细细胞。3酶解法：通过木瓜蛋蛋白酶和唾唾液蛋白酶酶使磁珠与与细胞解离离，再通过过磁场除去去游离磁珠珠，获得裸裸细胞。免疫磁珠分分离装置免疫磁珠分分离装置由由超强磁铁铁分离器和和分离柱组组成。磁铁铁和分离柱柱的型号多多样，配合合0.5ml、1.5ml微量离心管管，15ml及50ml离心管或试试管，和96孔或384孔培养板中中样品的分分离，以以满足不同同试验要求求。十一免疫疫磁珠分离离技术的应应用分离抗原抗抗体分离蛋白和和多肽分离多糖物物质分离DNA和RNA分离细胞和和病毒靶向释药系系统的载运运食品有害微微生物分析析与检测磁珠法分离离抗体、抗抗原、蛋白白、多肽、、多糖、DNA、RNA操作过程示示意图μMACSVitalvirusHiv分离试剂盒盒分离标记记造血细胞胞表面的Hiv-1病毒CD44H异型细胞免疫磁珠标标记细胞示示意图免疫磁珠分分离细胞及及病毒示意意图十二免疫疫磁珠在食食品安全检检测中的应应用免疫磁珠对对病毒细胞胞具有特异异选择性，，因此能用用于食品有有害微生物物的检测。。免疫磁珠技技术与常规规检验方法法相比具有有检测迅速速、有选择择性分离目目的微生物物，有效减减少背景干干扰，提高高了精准性性。同时还还能捕获受受损伤靶细细菌。目前前，免疫磁磁珠技术已已广泛用于于食品样品品中致病微微生物的检检测。大肠杆菌O157的检测传统分离E.coliO157∶∶H7所采用的直直接分离法法存在着鉴鉴别力差、、抑制杂菌菌能力弱、、耗时长、、工作量大大等缺点。。采用免疫磁磁珠技术，，能够快速速地从各种种食品样品品中分离富富集E.coliO157∶∶H7，满足流行行病学的研研究要求和和提高控制制力度。现在这种免免疫磁珠的方法已经经被英国公公共健康服服务实验室室认定为标标准的分离离方法，我我国也已将将免疫磁珠珠法对大肠杆菌菌O157的检测纳入入国家标准准（GB/T4789.36-2008）和出入境检验验检疫行业业标准(SN/T1059.5-2006)。已有市售售的专用免免疫磁珠销销售。检样25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n），均质225mL免疫磁珠捕捕获涂布CT-SMAC平板和改良良CHROMagarO157弧菌显色琼琼脂平板挑取可疑菌菌落5个~10个，氧化酶酶阴性，革革兰氏阴性性杆菌接种种TSIMUG-LST阳性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕捕获法检测测O157∶∶H7程序阴性血清学试验验非O157细菌生化试验报告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h1增菌2免疫磁珠捕捕获与分离离1.将Eppendorff管按样品和和质控菌株株进行编号号，每个样样品使用1支Eppendorff管，然后插插人到磁板板架上。在在漩涡混合合器上轻轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶溶液后，用用开盖器打打开每支Eppendo-rff管的盖子，，每管加人人20μLE.coli0157免疫磁珠悬悬液。2.取mEC+n肉汤增菌培培养物1mL，加人到Eppendorff管中，盖上上盖子，然然后轻微振振荡10s。每个样品品更换1支加样吸头头，质控菌菌株必须与与样品分开开进行，避避免交叉污污染。具体操作3.结合:在18℃~30℃环境中，，将上述Eppendorff管连同磁板板架放在DynalMXl样品混合器器上转动或或用手轻微微转10min，使E.coliO157与免疫磁珠珠充分接触触。4.捕获:将磁板插人人到磁板架架中浓缩磁磁珠。在3min内不断地倾倾斜磁板架架，确保悬悬液中与盖盖子上的免免疫磁珠全全部被收集集起来，此此时，在Eppendorff管壁中间明明显可见圆圆形或椭圆圆形棕色聚聚集物。5.吸取上清液液:取1支无菌加长长吸管，从从免疫磁珠珠聚集物对对侧深人液液面，轻轻轻吸走上清清液。当吸吸到液面通通过免疫磁磁珠聚集物物时，应放放慢速度，，以确保免免疫磁珠不不被吸走。。如吸取的的上清液内内含有磁珠珠，则应将将其放回到到Eppendorff管中，并重重复4步骤。每个个样品换用用1支无菌加长长吸管。6.洗涤:洗涤免疫疫磁珠混混合物，，重复上上述步骤骤4~6和4~5。7.免疫磁珠珠悬浮:将免疫磁磁珠重新新悬浮在在100μμLPBS-Tween20洗液中。。8.涂布平板板:用漩涡混混合器将将免疫磁磁珠混匀匀，用加加样器各各取50μμL免疫磁珠珠悬液分分别转移移至CT-SMAC平板和改改良CHROMagarO157弧菌显色色琼脂平平板一侧侧，再用用无菌涂涂布棒将将免疫磁磁珠涂布布平板的的一半，，用接种种环划线线接种平平板的另另一半。。待琼脂脂表面水水分完全全吸收后后，翻转转平板，，于36℃士10℃培养18---24h。菌落识别别在CT-SMAC平板上，，典型菌菌落为不不发酵山山梨醇的的圆形、、光滑、、较小的的无色菌菌落，中中心呈现现较暗的的灰褐色色;发酵山梨梨醇的菌菌落为红红色;在改CHROMagarO157弧菌显色色琼脂平平板上为为圆形、、较小的的菌落，，中心呈呈淡紫色色一紫红红色，边边缘无色色或浅灰灰色。初步生化化试验:在CT-SMAC和改良CHROMagarO157弧菌显色色琼脂平平板上挑挑取5个~10个典型或或可疑菌菌落，分分别接种种TSI琼脂，同同时接种种MUG-LST肉汤，于于36℃士1℃培养18h~24

h。必要时时进行氧氧化酶试试验和革革兰氏染染色。在在TSI琼脂中，，典型菌菌株为斜斜面与底底层均呈呈阳性反反应呈黄黄色，产产气或不不产气，，不产生生硫化氢氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波波紫外灯下观观察，无荧光光产生者为阳阳性结果，有有荧光产生者者为阴性结果果;对分解乳糖且且无荧光的菌菌株，在营养养琼脂平板上上分纯，于36℃士1℃培养18

h~24

h，并进行鉴定定。Fratamico等将兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗体连连接到羊抗兔兔IgG包被的磁珠上上，从食物增增菌培养液中中分离O157∶H7菌株，再将带带菌的磁珠接接种到培养基基上，加入荧荧光素标记的的O157∶H7抗血清，在荧荧光显微镜下下观察，此法法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。。Decory等建立了免疫疫磁珠-免疫脂质体（（IMB/IL）荧光试验方方法，可在8h内快速检测出出多种液态样样品（水样、、苹果汁、苹苹果酒）中低低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而传统微生生物学方法不不能从阴性样样本中区分出出E.coliO157∶H7感染样本。单核细胞增生生李斯特菌的的检测传统的单增李李斯特菌检测测方法检测周周期长，约5～14d，步骤繁琐且且灵敏度低，，而IMB技术的优点在在于在较低的的菌液浓度时时也可以通过过免疫磁珠的的富集作用进进行检测，缩缩短了检测时时间并进一步步降低了单增增李斯特菌的的检测限。2008年，我国将免免疫磁珠检测测单核细胞增增生李斯特菌菌的方法纳入入了出入境检检验检疫行业业标准中(SN/T0184.3-2008)。检样25g(mL)对225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL转种10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通过免疫磁珠珠捕获李斯特特菌，然后再再用灭菌缓冲冲液洗涤用0.1mL的灭菌缓冲液液重新制成悬悬液吸取50uL免疫磁珠悬液液划线于CHROMagar显色培养基，，OXA/PALCAM琼脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑选5个典型菌落接种于TSA-YE琼脂平板，纯纯培养鉴定和确认试试验单增李斯特菌菌的检测程序序与方法1样品制备2增菌3免疫磁珠分离离((IMS）1)免疫捕获混增菌培养液液.沉淀所有的粗粗糙食物残渣渣.从增菌培养液液中移取1mL上层液体(要尽可能避免免移取到食物物颗粒和脂肪肪颗粒)加人Eppendorf管中.加20μL准备好的免疫疫磁珠。在旋旋涡混合器上上混合该悬液液。2）分离将Eppendorf管固定在磁架架的管孔中。。1800轻缓摆动磁架架5次--6次,使免疫磁珠聚聚集到磁极。。小心地打开开磁架上的Eppendorf管管盖,从磁极对面一一侧慢慢吸出出液体，注意意不要接触管管壁上的磁珠珠。每一个样样品换一次枪枪头;加1

mI灭菌的PBS，并重新盖好好盖子.将磁极从支架架上移走，1800轻缓摆动磁架架5次一6次,使管内各成分分混合,后重新将磁极极放回到支架架上。重复该该清洗步骤几几次。将离心心管从磁性分分离器上移开开.并加100μL灭菌的PBS到管中，重悬悬磁珠。如实实验室没有磁磁性分离器，，可以用手摇摇代替.4.分离培养1）分离培养吸取50μL免疫磁珠悬液液.加到显色培养养基及任一选选择性培养基基OXA、PALCAM琼脂平板上.用无菌接种环环划线.35℃士1℃培养22h-48h。2）筛选李斯特氏菌在在CHROMagar显色培养基上上菌落为蓝色色.且在其周围形形成一个晕环环。李斯特氏氏菌在OXA琼脂平板上生生长22

h后菌落呈现黑黑色.直径为1mm.在其周围形成成一个黑色环环。培养48h，菌落仍呈黑黑色.直径2mm

--3mm.除在菌落周围围有一环外.在菌落中心部部位的深层也也形成黑点。。李斯特氏菌菌在PALCAM琼脂平板上与与在()XA琼脂平板上菌菌落相似。在在CHROMagar显色培养基及及OXA或PALCAM琼脂平板上挑挑取5个或更多可疑疑菌落.接种于TSA-YE琼脂平板上.纯培养后进鉴鉴定。5.鉴定和确认Skjerve等通过包被单单克隆抗体的的磁珠从不同同食物样品中中分离李斯特特菌，采用将将磁珠接种到到琼脂平板培培养的方法进进行菌株鉴定定，此法的敏敏感性为102～104cfu/mL样品。Hudson等研究表明，，将免疫磁珠珠技术与PCR结合，24h内即可检出火火腿中的单增增李斯特菌。。沙门氏菌的检检测Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的的沙门氏菌，，实验包括非非选择性增菌菌、免疫磁珠珠分离、DNA提取及PCR扩增，12～13h即可完成检测测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感感染肉类和人人工感染肉类类都具有较高高的敏感性和和特异性。Blackburn等将用生物素素标记的抗沙沙门菌多价多多克隆抗体连连接到链霉亲亲和素包被的的磁珠上，以以此试剂检测测从不同食物物中提取的活活沙门菌。此此法的敏感性性可达105cfu/g食物，总的检检测时间从5d减少至1~2d。IMB技术检测沙门门氏菌的优点点适用于各类食食品基质中的的沙门氏菌的的快速检测，，能快速有效效富集食品基基质中的目标标病原菌，且且有良好的灵灵敏度和特异异性，检测限限可达到1—10cfu/25g;在检测时间方方面可将常规规检测方法中中的72小时检测周期期缩短至40小时，而且能能有效减轻过过程交叉污染染;筛选结果既可可以与常规的的细菌生化和和血清学联用用，也可以和和显色培养基基、荧光PCR以及微生物全全自动鉴定仪仪器等方法联联用，为食源源性致病菌检检测和鉴定提提供有效快速速筛选技术。。金黄色葡萄球球菌的检测陈伶俐等将人人IgG结合到磁珠上上，用该磁珠珠对样品中的的金黄色葡萄萄球菌进行快快速分离检验验。取适量免免疫磁珠，加加入金黄葡萄萄球菌菌液中中，磁场下分分离磁珠，将将分离前后的的菌液及磁珠珠涂平板，并并用大肠杆菌菌、白葡萄球球菌等作对照照。结果用此此磁珠分离后后，只有金黄黄葡萄球菌的的浓度有明显显的降低。对对磁珠所涂平平板的菌落进进行鉴定，证证明为金黄葡葡萄球菌。应应用此法分离离检验此菌，，富集速度快快，灵敏度高高，效果好。。刘琳琳利用自自制的金属螯螯合免疫磁珠珠来检测食品品中金黄色葡葡萄球菌，该该法能够在30min内富集检测金金黄色葡萄球球菌且检测低低限可达100CFU，同时磁珠可可保持活性达达3周以上。副溶血性弧菌菌的检测Hara-Kudo等利用IMS和显色培养基基分离贝类中中产TDH的副溶血性弧弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭鞭毛的单克隆隆抗体,这将有益于快快速检测从环环境来源的副副溶血性弧菌菌。张凡非等利用用IMS分离环境及食食品中产生TDH副溶血性弧菌菌，分别从1份海水、1份海泥和3份蛤肉中检出出了神奈川现现象阳性,并产生耐热溶溶血毒素的副副溶血性弧菌菌,血清型为03:K6。IMB技术检测副溶溶血性弧菌的的优点该方法与一般般的细菌培养养分离法相比比,极大地提高了了环境样品及及食品中病原原性副溶血性性弧菌的检出出率。利用IMB可有效地吸附附、浓缩大量量样品中的少少量病原微生生物,IMB为难于从环境境及食品中分分离病原性副副溶血性弧菌菌的问题提供供一种有效手手段。其他致病菌的的检测志贺氏菌例：Islam等应用O抗原特异性单单克隆抗体包包被免疫磁珠珠，快速检测测粪便中的疾疾痢志贺菌和和福氏志贺菌菌。分离出的的志贺菌株用用PCR扩增方法进行行鉴定。此种种免疫磁珠分分离与PCR联合法检测志志贺菌，较传传统的培养法法敏感、快速速(7h)。小肠结肠炎耶耶尔森氏菌例：Kapperud等用抗小肠结结肠炎耶尔森森氏菌血清抗抗体包被磁性性微球，从食食物和水样中中分离，并能能将小肠结肠肠炎耶尔森氏氏菌与假结核核耶尔森氏菌菌和非致病性性耶尔森氏菌菌区别开来。。十三免免疫疫磁珠珠与其其它检检测手手段的的联用用免疫磁磁珠与与PCR的联用用由于PCR技术灵灵敏度度较低低，将将免疫疫磁珠珠技术术和PCR技术相相结合合，建建立了了新的的检测测系统统——磁免疫疫PCR技术。。例如如：它它以李李斯特特氏菌菌单抗抗包被被磁珠珠，对对样品品进行行前处处理，，将菌菌进行行富集集裂解解，再再以iap基因的的保守守区域域设计计引物物进行行PCR，结果果显示示该方方法具具有良良好特特异性性，而而且十十分灵灵敏。。免疫磁磁珠与与ELISA的联用用利用磁磁性微微球，，并以以兔抗抗甘草草蛋白白IgG抗体致致敏，，制备备特异异性捕捕获甘甘草特特征蛋蛋白的的免疫疫磁性性微球球。以以生物物素标标记抗抗体为为示踪踪抗体体，结结合辣辣根过过氧化化物酶酶标亲亲和素素建立立ELISA检测系系统，，用于于甘草草药材材和含含甘草草中成成药中中甘草草蛋白白的分分析。。结果果用用该方方法对对甘草草药材材和中中成药药中甘甘草蛋蛋白抗抗原检检测，，检测测灵敏敏度10ng／mL。免疫磁磁性捕捕获ELISA检测技技术方方便、、快速速、准准确，，为生生药的的品种种鉴定定及中中成药药的质质量控控制提提供一一种新新方法法。免疫磁磁珠与与发光光检测测技术术联用用将磁磁珠珠技技术术与与免免疫疫荧荧光光、、放放射射免免疫疫、、发发光光免免疫疫等等相相结结合合，，可可提提高高分分析析检检测测的的准准确确性性和和灵灵敏敏度度。。免疫疫磁磁珠珠荧荧光光微微球球十四四免免疫疫磁磁珠珠（（IMB）技技术术在在其其他他领领域域中中的的应应用用免疫疫检检测测IMB技术术在在医医学学领领域域有有广广阔阔应应用用前前景景，，它它可可以以检检测测肿肿瘤瘤细细胞胞，，如如骨骨髓髓中中肿肿瘤瘤细细胞胞的的检检测测、、淋淋巴巴结结中中肿肿瘤瘤细细胞胞的的检检测测。。另另外外这这种种技技术术还还可可以以对对肿肿瘤瘤进进行行磁磁导导向向治治疗疗和和免免疫疫磁磁性性净净化化治治疗疗。。细胞胞分分离离细胞胞分分离离是是免免疫疫磁磁珠珠目目前前最最主主要要应应用用的的一一个个方方面面，，传传统统细细胞胞分分离离技技术术有有的的比比较较费费时时，，有有的的十十分分昂昂贵贵，，由由于于免免疫疫磁磁珠珠技技术术分分离离细细胞胞时时只只需需要要抗抗体体和和磁磁铁铁，，既既简简便便灵灵敏敏又又经经济济快快捷捷。。如马马东东初初用用GPⅡⅡb/ШШa血小小板板单单克克隆隆抗抗体体结结合合磁磁珠珠分分离离人人骨骨中中的的巨巨核核细细胞胞，，其其纯纯度度达达到到87.5%到97.1%，且且50%的巨巨核核细细胞胞具具有有生生物物活活性性，，分分离离的的巨巨核核细细胞胞超超微微结结构构保保持持完完整整，，可可用用于于巨巨核核细细胞胞的的分分子子生生物物学学等等方方面面研研究究。。生物物大大分分子子纯纯化化免疫疫磁磁珠珠可可以以看看作作是是亲亲和和层层析析技技术术中中的的微微型型配配基基，，体体，，在在基基质质上上固固相相化化抗抗体体或或抗抗原原后后，，形形成成特特异异性性吸吸附附后后，，再再进进行行磁磁性性亲亲和和抽抽屉屉不不需需离离心心过过滤滤，，用用于于分分离离和和纯纯化化相相应应的的生生物物大大分分子子。。为为提提纯纯受受体体分分子子、、DNA、RNA、DNA结合合蛋蛋白白及及mRNA等提供希希望。分子生物物学的应应用免疫磁珠珠可借助助亲和素素——生物素系系统与非非蛋白结结合（如如各种DNA、RNA大分子））。先将将PCR双链产物物与生物物素化的的磁珠混混合使两两者结合合，然后后进行碱碱性变性性处理，，使PCR双股DNA成为单股股DNA，可直接接快速用用于检测测PCR样品中DNA或RNA分子并可可进行测测序。十五免免疫磁珠珠技术展展望优点:分离速度度快、效效率高、、可重复复性好、、操作简简单，不不需昂贵贵仪器设设备,不影响被被分离细细胞或其其它生物物材料的的生物学学性状和和功能等等,从而在微微生物检检测方面面具有很很大的优优势。缺点：免免疫磁珠珠敏感性性不高，，易于其其他杂菌菌交叉反反应，价价格昂贵贵，应用用受到一一定限制制。IMB发展的几几个方向向高敏感性性磁珠的的制造技技术降低磁珠珠生产成成本免疫磁珠珠与其它它检测手手段联用用技术免疫磁珠珠技术应应用技术术总的来说说，免疫疫磁珠分分离技术术未来将将在生物物医学、、食品、、农业科科研、新新药开发发等领域域具有更更加广泛泛的发展展前景。。Thankyouattention！9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Wednesday,December28,202210、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。21:26:4921:26:4921:2612/28/20229:26:49PM11、以我独独沈久，，愧君相相见频。。。12月-2221:26:4921:26Dec-2228-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。21:26:4921:26:4921:26Wednesday,December28,202213、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。12月-2212月-2221:26:4921:26:49December28,202214、他乡生白发发，旧国见青青山。。28十二月月20229:26:49下午21:26:4912月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月2