实验室常用分子生物学合集-精华版

PAGEPAGE41一细菌相关实验技术1.细菌分离鉴定1.1沙门氏菌分离鉴定1.1.1食品样前增菌取检样25g，加入225mL缓冲蛋白胨水于均质杯内。用均质器以8000-10000r/min打碎1min，于36±1℃培养4h(干蛋品培养18～24h)，取10mL于100mL亚硒酸盐肮氨酸（SC）增菌液内，于36±1℃培养18～24h。1.1.2食品样细菌分离取增菌液1环，划线接种于DHL琼脂平板，于36±1℃分别培养18～24h(DHL)或40～48h(BS)，观察平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ非食品样直接取棉拭子在DHL琼脂平板上划线即可。

表1沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）DHL琼脂无色半透明；产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色a)生化试验:自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。表2肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种-++/-+沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+++/-+沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌-++-沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属-+--伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+++/--大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌说明：在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。在接种三糖铁琼脂的同时，再接种碱性蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。

表3肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢靛基质尿素氰化钾赖氨酸判定菌属A1++沙门氏菌属A2++--+沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3+-++-弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4++++-普通变形杆菌B1+-沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属B2--+++-大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3+/-++++-克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4-++/-+-摩根氏菌、普罗菲登斯菌属反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。

表4肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-2尿素氰化钾赖氨酸判定结果--+-+--++甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。表5肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表-3甘露醇山梨醇判定结果+-+-沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果）缓慢爱德华氏菌反应序号B1：补做ONPG。ONPG（+）为大肠埃希氏菌，ONPG（-）为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸（+），但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸（-）。1.1.3沙门氏菌PCR方法a)煮沸法提取基因组DNA模板b)引物设计fliC-1:5’-GGCTATTATGAAGTTTCCGTTG-3’fliC-2:5’-GGGCAGAAGTCAGGTTGTTTAC-3’sefA-1:5’-AATTGTGCGAATGCTAATAGTTG-3’sefA-2:5’-TGATACTGCTGAACGTAGAAGGTC-3’c)反应体系：单重和二重PCR体系的总体积均为30mL，其中包括：1×PCR反应缓冲液，dNTP0.2mmol/L，引物各25pmol/L，1.5UTaqplus聚合酶，3uLDNA模板。d)扩增条件：优化后的PCR反应程序为94℃预变性5min，然后进入循环程序：94℃变性30s，56℃退火30s，72e)结果扩增出了622bpfliC基因片段的为鼠伤寒沙门氏菌，扩增出534bpsefA基因片段的为肠炎沙门氏菌。1.2猪链球菌的分离鉴定—PCR方法培养基：1）TSB（TryptoneSoyaBroth）选择性平板：4%绵羊血、3%TSB、1.5%琼脂粉及以上三种工作浓度试剂；2）BHI培养基：3%BHI、3%新生牛血清；3）BHI保存液：3%BHI、3%新生牛血清、15%甘油；1.2.1操作步骤：a)喉部棉拭采样；b)接种血平板（只接种一个区域，转动棉拭）；c)一次性接种环划线（2-3个区域，以期获得分散性较好的菌落）；d)37℃e)牙签挑选疑似菌落（β溶血、针尖状灰白色菌落）接种于BHI血清培养基，37℃f)煮沸法取1ML菌液提DNA模板，其余菌液4℃g)双重PCR扩增目的基因：引物：gdh-1：GCTGCGTATTCTGTCAAACGgdh-2：CGATGGACAGATAAAGATGGcps2j-1：TGAGTCCTTATACACCTGTTcps2j-2：AGAAAATTCATATTGTCCACC反应体系与条件：template3µlddH2O17µl2.5MdNTP0.6µl10PCRbuffer3.0µl25uMgdhprimers1.2µl25uMcps2jprimers2.4µlTap-plus0.8µl总体积30µlPCR扩增条件：94℃5min，94℃1min、50℃40s、72℃50s进行30循环后，h)从猪链球菌2型和非2型PCR阳性管重新划线接种于血平板37℃培养18-24小时，同时接种PCR阳性菌液-80g)镜检观察猪链球菌2型疑似菌落形态特征是否单一；k)生化鉴定复核；l)猪链球菌2型和非2型猪链球菌PCR阳性的菌株4℃保存管重新接种血清BHI，培养至对生长期后离下细菌，以BHI保存液重悬，置-801.3副溶血弧菌分离鉴定—PCR方法1.3.1操作步骤a)以无菌操作取25g或25mL样品，液体摇匀或固体置于灭菌均质袋经搅拌均质器搅拌均匀后加至225mL碱性蛋白胨中，置于37℃b)用接种环取少许培养液到TCBS选择性培养基上培养8-10h，c)挑取绿色菌落，纯化培养d)提取DNA模板：取37℃培养过夜的副溶血弧菌菌液1.5mL加入Eppendorf管中，12000rpm离心1min，弃上清；用灭菌ddH2O悬浮细胞，12000rpm离心1min，弃去上清；加入2×TZ和ddH2O各40µl，充分混匀；-20℃放置45mine)引物设计合成：gyrB-a：CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGTgyrB-b：TCCGCTTCGCGCTCATCAATAtlh-a：AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTGtlh-b：GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCf)PCR反应体系PCR扩增均在30µL反应体系中进行，每种物质的浓度及加样量如下：10×PCRbuffer3µl10mMdNTP0.5µltlh-F(50µmol/L)0.5µltlh-R(50µmol/L)0.5µlgyrB-F(50µmol/L)0.5µlgyrB-R(50µmol/L)0.5µltemplate3.3µl2U/µlTaqPlusDNA聚合酶0.7µlddH2O20.5µlg)扩增条件：94℃3min；94℃1min，58℃1min，72扩增产物用含0.5μg/mLGoldview染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照记录结果。k)结果：在285bp及450bp处均有特异条带的为副溶血弧菌。1.4单增李斯特菌的分离鉴定—PCR方法培养基：1）EB1:TSB加萘啶酮酸(18mg/l),丫啶黄(10.8mg/l)2)EB2TSB加萘啶酮酸(16mg/l),丫啶黄(20mg/l)3)李斯特菌选择性培养基购自科玛嘉公司1.4.1操作步骤a)以无菌操作取25g或25mL样品，液体摇匀或固体置于灭菌均质袋经搅拌均质器搅拌均匀后加至225mLEB1增菌液中，置于37℃b)将样品转种至EB2增菌液中,37℃c)用接种环取少许培养液到李斯特菌选择性培养基中培养18-24h；d)挑取蓝色菌落，纯化培养；e)煮沸法提取基因组DNA模板；f)PCR检测PCR扩增均在30µl反应体系中进行，每种物质的浓度及加样量如下：10×PCRbuffer3µl10mMdNTP0.5µlΜLisA(50µmol/L)1µlMonoA(50µmol/L)0.8µlLisB(50µmol/L)1µlHA-1(50µmol/L)0.6µlHA-2(50µmol/L)0.6µltemplate3µl2U/µlTaqPlusDNA聚合酶0.6µlddH2O18.9µlg)扩增条件：94℃3min；94℃1min，62℃30sce，72℃1min，30个循环；扩增产物用含0.5μg/mLGoldview染料的1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照记录结果。h)结果：在720bp及400bp处均有特异条带为单增李斯特菌。2.细菌冻存2.1甘油冷冻保藏法:本法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。a)挑取单菌落，接种于装5mL的15mL离心管中37℃振荡培养8-12小时，至菌密度OD600b)按60%甘油：菌液为1：2（V/V）的量加入甘油和菌液分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），混合后，-80℃3．药物敏感性试验原理：各种病原菌对抗生素药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性也有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有效药物，用于临床治疗，对控制细菌传染病的流行至关重要。材料：试管、各种细菌、镊子、标签、药敏片，棉试子、各种抗生素3.1检测菌和标准菌的准备按细菌菌量计算标准准备接种菌量。生长后的菌液用MH肉汤矫正浓度至0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释10倍（含菌量大约107CFU/mL），对生长条件要求较高的细菌,如链球菌属和肠球菌属等细菌需在MH琼脂加5%脱纤维羊血或兔血中进行。稀释后的菌液尽快在15分钟内接种。3.2接种用微量加样器分别取0.18mL检测菌液到第一排的96孔聚苯乙烯U形微孔板中，其他孔中加0.18mL菌液。最终接种菌量约5*105CFU/mL。加样时加样器吸头必须插到管内面下加菌并注意避免与管内壁接触。3.3加抗菌药物在第一排0.18毫升检测菌液的孔内分别加入20μL相应抗菌药物，混匀。3.4稀释用微量加样器自第一排吸取100μL液体加入第二排，充分混匀后，再自第二排吸取100μL液体加入第三排，混匀。以此类推，直至第8排，最后自第8排中吸取100μL液体弃去。3.537℃培养14-18h后记录无细菌生长的孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。注：质量控制：每批实验时需根据检测菌分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，粪肠球菌ATCC29212，和铜绿假单胞菌ATCC27853，等标准菌株在同一试验条件下进行测定。常用抗菌药物对这些标准菌株的MIC的预期取值范围可参考有关资料判断。超过或低于一个稀释度以上时，应检查出错的原因以及标准菌株被污染或变异的可能性。

二病毒相关实验技术1.病毒分离1.1粪便样品处理取1g粪便加入9mLRPMI1640培养液混匀后，加入500μL氯仿，充分混匀后4000rpm离心15min，取上清过滤除菌，-70℃保存备用。1.2病毒分离将处理好的样品按培养液体积的1/10同步接种刚消化分瓶的F81细胞，置37℃5％CO2中静置培养。每隔12h观察细胞的生长情况。待细胞病变达80％以上时刮取细胞并离心收集，培养液重悬后反复冻融三次，12000rpm离心10min，取上清-70℃保存作为盲传或鉴定用的病毒液。2.病毒鉴定2.1PCR检测：材料：PCR反应所需试剂（见第三章PCR部分）、加样器、枪头、PCR仪。2.1.1DNA提取：采用UNIQ-10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒，从病料中提取病毒基因组DNA，具体操作如下：a)取少量病料放入离心管内，加入300μLTE缓冲液混匀，12000rpm离心5min，取上清煮沸10min，随后冰浴5min；b)取上清200μL至eppendorf管中，依次加入400μLDVIBuffer和3μLProteinaseK（20mg/mL），混匀，55℃c)加入260μL无水乙醇，混匀，用1-mLTip头将样品全部转移至UNIQ-10柱，柱子放入2mL收集管中，10000rpm室温离心1min；d)取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，加入500μLWashSolution，10000rpm室温离心1min；e)重复步骤4）一次；f)取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，10000rpm室温离心1min，以除去残留的WashSolution；g)将UNIQ-10柱子放入一新的eppendorf管中，在柱子中央加20μLElutionBuffer，室温放置2min；h)12000rpm室温离心1min，eppendorf管中的液体即作为PCR反应模板。g)进行PCR反应（具体操作间分子生物版）2.2HA-HI试验原理：抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互聚集形成肉眼可间的凝集小块或沉淀物，根据是否产生凝集现象来判定相应抗体或抗原。材料:孔反应板、移液器、滴头、微型振荡器、生理盐水、0.5%鸡红细胞悬液、病毒液、阳性血清。2.2.1猪红细胞悬液的制备a)采集健康猪血液置灭菌离心管中，加入2倍体积的生理盐水，2000rpm离心10min，弃上清，反复洗涤3次；b)用0.02MPBS（pH7.0）重悬，制成10％红细胞悬液；c)缓慢加入等量戊二醛，室温搅拌醛化2-3h至红细胞呈褐色；d)用0.01MPBS（pH7.0）反复洗涤5次，并配成20％红细胞悬液；f)加入硫酸汞使弃终浓度为0.1%，置于4℃g)醛化后的红细胞呈咖啡色，形态完好无自凝现象，在蒸馏水中不溶血。2.2.2血凝（HA）试验本试验采用微量法在96孔V形板上进行，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，最后加入等体积红细胞悬液，置于4℃判定标准：红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100％凝集(#)、75％凝集(+++)、50％凝集(++)、25％凝集(+)。其血凝价（凝集单位）以红细胞100％凝集的病毒液的最高稀释倍数表示。表1.血凝试验操作表Table1Procedureforhemagglutinationtest孔号123456789101112病毒液稀释度212223242526272829210211空白对照0.02MPBS(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05病毒液(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.050.5%红细胞悬液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.2.3血凝抑制（HI）试验本实验采用抗犬细小病毒单克隆抗体作为血凝抑制的抗体，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，分别加入等体积的病毒液（4个凝集单位）,37℃作用1h后，最后加入红细胞悬液，置于4℃作用1h，待抗体对照孔红细胞完全沉淀后再读取结果，操作方法见表2。判定标准：在抗体对照不发生凝集，抗原对照完全凝集的前提下进行判定。红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100％凝集(#)、75％凝集(+++)、50％凝集(++)、25％凝集(+)。其血凝抑制效价以红细胞凝集完全被抑制的抗体最大稀释倍数表示。表2.血凝抑制试验操作表Table2Procedureforhemagglutinationinhibitiontest孔号123456789101112抗体稀释度212223242526272829210抗原对照抗体对照0.02MPBS(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05CPV单抗(mL)0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05弃去0.050.054单位病毒液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.05－37℃0.5%红细胞悬液（mL）0.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.050.052.3间接免疫荧光(IFA)试验原理：通过荧光素对抗体或者抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应抗原或抗体的方法材料：长满F81的细胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生长液、96孔细胞培养板、加样器、枪头、荧光显微镜、病毒液（PRV）2.3.1操作步骤a)将F81细胞以105/mL接种24孔板，500μL/孔，并按培养液1/10体积同步接种病毒液，同时设不接毒的细胞孔作为阴性对照；b)37℃5％CO2中静置培养24h后，停止培养，用0.02Mc)-20℃d)PBS洗涤3次，每次5min；e)抗CPV单抗作为一抗，用含0.5％脱脂奶粉的PBS进行100倍稀释，加入培养孔中（300μL/孔），37℃f)PBS洗涤3次，每次5min；g)每孔加入300μL羊抗鼠IgG-FITC（200倍稀释），37℃h)PBS洗涤3次，每次5min；i)50％甘油PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。2.4病毒感染力的滴定（TCID50的测定）材料：长满单层的细胞1瓶、胰酶、吸球、吸管、生长液、96孔细胞培养板、加样器、枪头病毒液（PRV）2.4.1：测定病毒感染力的方法：半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecμLtureinfectivedose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测2.4.2：TCID50的操作步骤a)在每孔加入细胞悬液90µl，使细胞量达到2~3×105个/mL。b)在EP管中用MEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10c)将稀释好的病毒接种到24孔培养板中，每一稀释度接种8个空，每孔接种10µl。d)设正常细胞做阴性对照。e)3天后做间接免疫荧光。f)结果按Reed-Muench法计算。

三分子生物学、免疫学及细胞生物学部分1.PCR技术1.1基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1:模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃2:模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃3:引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。1.2PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10μL

4种dNTP混合物每个浓度200umol/l

引物每个浓度10-100pmol

模板DNA0.1-2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/l

加双或三蒸水至100μL

1.3PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。a)引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，在特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中能加上合适的酶切位点，或被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。b)引物量：每条引物的浓度0.1～1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。c)酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μL时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。d)dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+e)模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。e)Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。1.4PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。a)温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时b)循环次数:循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。2.重组质粒载体构建载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增好表达的工具。粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒DNA不但能在细菌中复制，而且在添加真核复制信号好启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒。构建质粒载体及鉴定工作可以分为七步基因组的获取目的片段的扩增与纯化目的片段和质粒的双酶切及纯化(确保双酶切的精确性)目的片段与质粒载体的连接感受态的制备转化重组质粒的鉴定以下将逐步介绍：2.1基因组DNA的提取方法（提模板）2.1.1煮沸法将细菌过夜培养物离心，用灭菌双蒸水洗涤1次200ul，加入40ul等体积灭菌双蒸水和TZ（4%TritonX-100和5.0mg/mLNaN3溶于pH8.0Tris-HCL）重悬，放置-20℃0.5h后，沸水浴处理10min，冰浴10min，6000rpm离心3min，收集上清液2.1.2蛋白酶K法a)3mL过夜培养物10000rpm离心1min；b)弃上清，用500μLSolutionI重悬c)加入60μL50mg/mL溶菌酶（因用量比较小，注意将溶菌酶直接称量在EP管内配制。G-菌可适当减少溶菌酶用量），37℃水浴作用30d)加入30μL10%SDS和2.5μL20mg/mL蛋白酶K，65℃水浴作用3h（可延长时间，可水浴中过夜）e)加入等体积的酚/氯仿异戊醇抽提（1：1，大约各300μL），10000rpm离心8min；（此处所指氯仿异戊醇是指氯仿：异戊醇=24：1）f)取上清，重复⑤3-4次；g)小心吸取上清，并加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc,室温沉淀30min；h)10000rpm离心12min，弃上清；i)用70%乙醇淋洗沉淀，10000rpm离心8min；j)37℃k)用20μL含10μg/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暂离心，调终浓度至约200ug/ml备用。2.1.3试剂盒法(见说明书)2.2目的DNA的PCR扩增(见上叙PCR技术)2.3目的DNA纯化(AXYGEN试剂盒割胶回收)2.4DNA双酶切及双酶切产物纯化2.4.150μL双酶切体系(以PstⅠ和KpnⅠ为例)10XMBuffer5μLPstⅠ(10u)3μLKpnⅠ(10u)3μLDNA（PCR纯化产物或者质粒）10-18μL4-6ug补加ddH2O至50μL2.4.2短暂离心，37℃2.4.3双酶切产物纯化a)补加TE溶液至400μL；a)加入等体积的酚/氯仿抽提，12000rpm，4℃a)上清加800μL无水乙醇及50μL3MNaAc，室温沉淀20min；a)12000rpm，4℃a)70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm，4℃a)烘干沉淀，并用一定量的TE溶解；a)取2μL电泳，估计浓度，确定下一步连接需要量。2.5双片段的连接（用DNALigationKitVer.2进行）按下面体系依次加入溶液已纯化PCR双酶切产物A适量已纯化质粒双酶切产物B适量SolI5-10μL(等于A+B总体积)混匀，短暂离心，16℃连接过夜。2.6感受态的制备2.6.1大肠杆菌感受态细胞的制备(CPG法)a)取-80℃冻存的E.coli(JM109、DH5α、BL21、CP-RP)菌株，在新鲜的LB平板上划线，37b)挑取单菌落，接种于5mL试管，37℃c)将过夜培养的菌液按1:100接种于一定体积的SOB中，37℃振荡2-3h至OD600d)将细菌移入50mL离心管(预先4e)4℃f)加入一定量预冷的CPG（每管约2mL，轻轻悬浮；4℃，4500rpm，离心10min；去上清，以预冷CPG悬浮（每50mL菌液加1.5-2mLCPG），0.1-0.2mL分装-80g)此法可使感受态细胞保持3个月以上的稳定活性。另，分装后在42.6.2CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞a)用接种环蘸取E.coliDH5α菌株，在不含Amp的LB平板上表面划线，37℃b)培养16hrs后，从平板上挑取单菌落，接种于5mL不含Amp的LB液体培养基中，37℃c)取1mL加至100mL不含Amp的LB液体培养基中，37℃d)取20mL培养液，转入预冷50mL离心管中冰上放置20min（2管）；e)4000rpm，4℃f)弃上清，倒置离心管，用吸水纸吸干，每管加预冷的5mL75mmol/LCaCl2溶液，轻轻吹打，冰上放置20min；g)2000rpm，4℃h)弃上清，并用预冷的含15%甘油的75mmol/LCaCl2溶液重悬，分装成200μL小份/eppendorf，-70℃2.7转化a)200μL感受态细胞，冰上解冻至刚好融化；b)取10μL连接反应液，加至感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，冰上放置30min；c)42℃d)马上加入LB液体培养基（不含Amp）1mL，混匀，200rpm，37℃f)6000rpm，室温离心5min，吸去1mL上清，用剩余的200μL溶液重新悬浮细菌沉淀；g)将细菌悬浮液200μL涂布到含100μg/mL的氨苄平板上，37℃h)16hrs后，挑单菌落接种与5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃2.8重组质粒鉴定2.8.1碱裂解法小量制备质粒DNAa)取1.5mL细菌培养液于Eppendorf管中，12000rpm，4℃b)沉淀菌体重悬于100μL的SolutionI，振荡混匀，室温放置5min；c)加入新鲜配制的SolutionII200μL，温和颠倒数次，冰浴5min；d)加入SolutionIII150μL，上下颠倒混匀，冰浴5min；e)12000rpm，4℃f)将水相转入干净的Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀，12000rpm，4℃g)将水相转入干净的Eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc，振荡混匀，室温放置30min；h)12000rpm，4℃i)加1mL70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm，4℃离心8min，弃上清，倒置于吸水纸上吸干液体；37j)用20μL含10μg/mL的TE溶液(pH8.0)溶解DNA，短暂离心备用。2.8.2双酶切鉴定重组质粒利用外源基因引入的PstⅠ、KpnⅠ酶切位点，对重组质粒进行双酶切鉴定；同时用特异性引物进行PCR鉴定。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果并拍照。3.重组质粒在大肠杆菌中的表达基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而产生有重要作用的蛋白产品。基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统，大肠菌表达系统属于原核表达系统3.1重组菌的诱导表达a)取测序正确的阳性菌以1:100接种于含硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养3h（OD600约等于0.5）b)加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，培养4h；c)室温8000rpm离心10min收集菌体；d)弃上清后加入适量50mMPBS（pH7.4）悬浮细菌，反复吹打后，8000rpm离心10min；e)弃上清，加入培养基1/10体积的50mMPBS（pH7.4）重悬细菌，取1mL超声波破碎（300W，4S/4S，99次）；f)12000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS分析。3.2重组蛋白可溶性分析a)SDS电泳板的处理用中性洗涤剂清洗后，再用双蒸水淋洗，然后用酒精棉球擦拭，吹风机吹干备用。b)15％分离胶的制备在10mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水1.1mL30%丙稀酰胺溶液2.5mL1.5MTris(pH8.8)1.3mL10%SDS0.05mL10%过硫酸铵0.05mLTEMED0.005mL充分混匀，立即缓慢倒入已固定好的两电泳板之间的狭槽中，马上轻轻覆盖一层双蒸水，室温静置至胶完全聚合，除去上层水相，用滤纸吸干水分。c)浓缩胶的制备在10mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水1.4mL30%丙稀酰胺溶液0.33mL1.0MTris(pH6.8)0.25mL10%SDS0.02mL10%过硫酸铵0.02mLTEMED0.002mL充分混匀，立即缓慢倒入分离胶上层的狭槽中，将样品梳插于槽上部，室温静置，待聚合完全后拔去梳子；d)SDS蛋白电泳缓冲液配制：Tris1.5gSDS0.5gGlycine7.2g溶于500ml蒸馏水中。d)样品处理分别取上清和沉淀40μL，加入5×SDS上样缓冲液10μL后，沸水浴作用10min，12000rpm离心5min后取10μL上清作为SDS电泳样品；e)电泳在电泳槽中加满电泳缓冲液，用微量上样器上样。150V，3mA，4W，电泳至溴酚蓝迁移至胶下缘结束；f)染色电泳完毕后，小心取出凝胶，置于大的平皿中，倒入染色液至浸没凝胶，于水平摇床上染色45min；g)脱色倒去染色液，加入脱色液至浸没凝胶，于水平摇床上脱色至背景消失，中间换液数次。脱色完毕后，观察目的蛋白有无表达。3.3.蛋白过柱纯化选择含有pET30a-VP2质粒的阳性重组菌大量诱导表达，用Ni-NTA蛋白纯化系统进行纯化，步骤如下：a)离心收集IPTG诱导的重组细菌，50mMb)用培养基1/10体积的8M尿素50mMPBS（pH7.4）重悬细菌，并超声波破碎（300W，4S/4S，99次）；c)12000gd)混匀填料，根据培养物量及其表达水平装柱2mL，并用3个柱床体积洗涤缓冲液（含8M尿素50mMPBS）平衡柱子；e)在柱中小心加入样品，打开开关使液体流出（流速为滴/10s）；f)反复上样三次；g)用3个柱床体积的含50mM咪唑的洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白；h)用3mL含400mM咪唑的洗涤液洗脱蛋白，并取少量进行SDS电泳检测蛋白纯度；i)柱床用完后，在上面小心覆盖20％乙醇适量，4℃3.3.1Bradford法测定蛋白浓度按表1依次将试剂加入96孔板上相应孔，每种两个重复，所测样品根据蛋白电泳估测浓度选择合适量替换表中标准溶液也同时加入板中，也设两个重复，放入多功能连续光谱仪振荡，用仪器自带Bradford法程序读取数据，经过设定后仪器即自动绘制标准曲线，同时给出所测蛋白浓度。表1.重组蛋白浓度的测定Table1Quantificationofpurifiedrecombinantprotein.孔号1234567890.02MPBS(μL)2019.51918.51817.51716.516BSA标准试剂(μL)00.511.522.533.54Bradford工作液(μL)2002002002002002002002002003.4Western-blot分析重组蛋白反应原性a)将原核表达产物、纯化后的重组蛋白及E.coliRosetta株进行SDS，电泳步骤同上。电泳结束后，将凝胶取出，用转移缓冲液洗涤两次，用于电转移；b)转膜：剪取与需要转移的聚丙烯酰胺凝胶大小相同的滤纸2张、NC膜1张，用转移缓冲液浸泡15min；将1张滤纸铺在负极石墨板上，依次铺上聚丙稀酰胺凝胶、NC膜和另外1张滤纸，用玻璃棒来回滚动几次，以赶走气泡，再放上盖板，20V，350mA，7W转移45min；c)转移完毕后，NC膜放入平皿，用TBST洗涤一次，放入新配制的5％脱脂奶粉TBST中37℃封闭2d)CPV阳性血清用0.5％脱脂奶粉的TBST稀释50倍后，浸入NC膜，37℃作用1e)用TBST洗涤NC膜5次，每次5min；f)羊抗犬IgG-HRP500倍稀释，浸入NC膜，37℃作用1g)重复步骤5；h)显色将适量显色底物4-CN用5mL甲醇溶解，再加入22.5mLTBS，待完全溶解后再加入15μL30％H2O2，将NC膜浸入其中，待出现明显的条带或背景时，用水冲洗NC膜终止反应。3.5间接ELISA方法的建立以重组蛋白作为抗原，以标准阳性血清和阴性血清作为一抗，羊抗犬IgG-HRP作为二抗，进行棋盘滴定试验以优化抗原包被浓度和一抗稀释倍数，具体步骤如下：a)将纯化的重组蛋白按16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL包被96孔板，每孔100μL，37℃温育2h后，4b)去酶标板中包被液，用200μLPBST洗涤3次，每次3min；c)5％脱脂奶粉37℃封闭2h，每孔200μLd)洗涤同2)，将细小病毒阳性血清和阴性血清分别用含5％脱脂奶粉的PBST稀释50倍和100倍后，加入96孔板中，每孔100μL，37℃e)洗涤同2),加入二抗（1000倍稀释，每孔100μL，37℃f)洗涤同2)，加入OPD显色液，每孔100μL，37℃g)每孔加入50μL2M硫酸，终止反应。测定OD492；h)选择阴性OD492小于0.15，且P/N值最大时的抗原包被浓度和血清稀释倍数作为最佳工作浓度。4.免疫组织化学方法用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。4.1操作步骤：石蜡切片放入55℃烘箱30min，或37℃过夜。a)常规脱蜡水洗:二甲苯Ⅰ（5-10min），二甲苯Ⅱ（5-10min），100%酒精Ⅰ（1-3min），100%酒精Ⅱ（1-3min），95%酒精Ⅰ（1-3min），95%酒精Ⅱ（1-3min），85%酒精（1-3min），75%酒精（1-3min），流水冲洗使切片干净（10min），PBS洗3min×3。b)灭活内源酶：每张切片滴1滴或50μL新配制的3%H2O2），室温孵育10min，PBS洗3min×3。c)抗原修复：将切片置于煮沸的枸橼酸盐缓冲液中15min左右。d)封闭：每张切片滴1滴（或50μL）1%BSA，室温孵育10min，不需清洗，使形成一薄膜，吸干周围水痕。e)加一抗：每张切片滴1滴或50μL用PBS适当稀释的一抗，37℃f)加二抗：每张切片滴1滴或50μL二抗，室温孵育30-45min。PBS洗3min×3，干净软纸吸干周围水痕。h)加底物：每张切片滴2滴或100μL新鲜配制的底物溶液(DAB)，显微镜下观察，待阴性有非特异性染色后终止，自来水缓缓冲洗。i)复染：苏木精3min，盐酸酒精分化片刻（蘸一下），自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水至100%，如有蜡尚需用二甲苯脱蜡。中性树胶封片。5.RNA的体外转录与转染5.1线性化DNA模板的准备a)体外转录前取1.5μgDNA用合适的酶进行线性化。b)按常规方法纯化DNA，并溶解于6.5μL无RNase的水中。c)取0.5μLDNA电泳检查酶切的完整性。5.2RNA的体外转录a)溶解10×reactionbuffer和2×NTP/CAP。溶解后将buffer放置于室温中，但将NTP/CAP放于冰上。b)在ep管中依次加入10μL2×NTP/CAP，2μL10×reactionbuffer，6μL线性化的DNA和2μL的RNA聚合酶。c)离心混匀后37℃d)加入1μLDNase作用15分钟。e)随后加入30μL水和30μLLiCl在-20℃f)12000rpm离心15分钟。g)70%乙醇洗涤RNA一次。h)自然干燥后溶解于10μL无RNase的水中。5.3RNA的电转a)电转前一天将PK-15以1:3的比例消化培养。b)细胞消化后，将细胞数调整2~2.5×106cells/reaction。c)10μgRNA与细胞混合后加入0.2mm的电转杯中。d)在200Vand500μF的电转参数下电击细胞一次。e)电转后加入4mL10%FBS的MEM，并铺于细胞培养瓶中。f)5天后可将细胞传代一次，随后进行鉴定。6.同源重组方法构建单增李斯特菌突变株同源重组是指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。6.1重组穿梭质粒（pKSV7-X）电转入单增李斯特菌(Lm)感受态细胞中6.1.1a)挑取Lm单菌落到BHI肉汤中，37℃b)取1mL过夜培养物到100mLBHI（含0.5M蔗糖）中扩大培养4.5h，至OD600值到0.2；c)加入青霉素G（终浓度为10μg/mL）,37℃振荡培养2h，使OD600d)8000rpm，4℃，离心e)菌体沉淀分别用等量和1/2量1mMHEPES（含0.5M蔗糖）洗涤一次，7000rpm，4℃，离心10f)用5mL1mMHEPES（含0.5M蔗糖）重悬细菌，加入15μL（根据细菌的量而定）50mg/mL溶菌酶，充分混匀后，37℃温育20g)5000rpm，4℃h)分别用等量和1/2量1mMHEPES（含0.5M蔗糖）洗涤菌体沉淀，5000rpm，4℃i)用一定量（视细菌浓度而定）的1mMHEPES（含0.5M蔗糖）重悬细菌，分装成80μL小份/eppendorf，-80℃6.1.2a)将5μL重组穿梭质粒pKSV7-X加至Lm感受态细胞中，轻轻混匀，并全部转移到预先处理过的电转杯中；b)将电转仪电压调至1KV并进行电击，完毕后马上在电转杯中加入1mLBHI（含0.5M蔗糖）,冰上放置30min后，转到eppendorf中，30℃c)6000rpm，4℃e)弃1mL上清，用剩余液体悬浮细菌并涂布到含氯霉素（10μg/mL）的LB（即LB+cm10）平板中，30℃6.1.3a)从LB+cm10平板中挑取单菌落到含氯霉素（10μg/mL）的BHI(即BHI+cm10)肉汤中，41℃b)碱裂解法提取该可疑阳性转化子的质粒DNA；c)以抽提的质粒DNA为模板，以相应引物对进行PCR鉴定以确定质粒是否已转入Lm中。6.2同源重组a)将阳性转化子转接种到BHI+cm10肉汤中，41℃b)将第6代细菌培养物划线接种到BHI+cm10平板上，41℃c)从BHI+cm10平板上挑取单菌落到BHI肉汤中，30℃e)BHI30℃f)将末代细菌培养物划线接种到BHI平板上，37℃g)挑单个菌落分别到BHI和BHI+cm10两种培养基中，30℃h)筛选可疑阳性重组子（即无cm抗性）,若无可疑重组子，则继续重复步骤4-6，直至出现可疑阳性重组子；i)提取该可疑细菌的基因组模板（蛋白酶K法）；g)PCR鉴定阳性重组子（选用旁测引物）7.细菌粘附、侵袭和细胞内增殖试验细菌培养至数生长期后，调整OD600至0.12左右(约1108cfu/mL),十倍稀释到DMEM细胞培养液中,以每孔300L(12孔板)的量加入到融合度为80%左右的Hela单层细胞中，在37C和5%CO2条件下感染1hr后加入100μg/mL庆大霉素以杀灭细胞外细菌,PBS洗涤两次后，再换用含10μg/mL侵袭率计算公式为：胞内细菌数加入孔内的细菌数100,而细菌粘附力的测定则在感染后1h经PBS洗涤后直接裂解，计算公式为：（胞内细菌数+胞外细菌数）加入孔内的细菌数100。细胞内增殖则用不同培养时间段（3hr,5hr,8hr,12hr等）的细胞裂解数与庆大霉素作用1hr后的细胞裂解数之间的对数差值表示。采用t检验对两菌株的黏附、侵袭和细胞内增殖进行统计学分析。8.细菌空斑形成试验调整细菌浓度为1×108cfu/mL,以每孔5μL的量加入到融合度为80%左右的L929单层细胞中，在37C和5%CO2条件下感染1hr，用0.01MPBS(pH7.4)洗涤3次后，覆盖3mL含0.7%琼脂糖和20μg/mL庆大霉素的DMEM。待出现可见的空斑后（2-3天）覆盖29.细胞毒性试验乳酸脱氢酶（LDH）是存在于细胞胞浆内的一种酶，参与糖酵解途径中的丙酮酸与乳酸相互转化。如果细胞膜受损，LDH自胞内释放至培养液中。而丙酮酸与2，4——二硝基苯肼可反应生成红棕色的丙酮酸二硝基苯肼。因此，使用比色仪就可以定量衡量细胞的受损程度。NADNAD++乳酸丙酮酸+NADHLDHNADH+2，4——二硝基苯肼黄递酶丙酮酸二硝基苯肼+NAD+9.1操作步骤参照试剂盒说明书的方法并加以改进。a)HeLa细胞经PBS洗涤一次后，用70μLM99培养基培养；b)细菌过夜培养物12000rpm离心6min，取上清进行10倍稀释；c)在各细胞培养孔中加入70μL细菌上清液，37℃、5%CO2d)从各细胞培养孔中吸出50μL上清液，12000rpm离心8min；e)加10μL裂解液/100μL，37℃、5%CO2作用45min（中间可用枪头吹吸，不能用手拍打f)吸取上清液至Eppdorf管中，12000rpm离心6min后加入对应位置的96孔中；g)避光加入50μL底物混合液；h)室温避光作用30min；i)避光加入50μL终止液；g)酶标仪读取OD492细胞毒性计算公式为：××100细胞毒性（%）=OD试验孔-OD空白孔OD阳性孔-OD空白孔10.转座子插入突变转座子是一类在很多动物中（包括线虫、昆虫和人）发现的可移动的遗传因子。转座子插入突变：即通过人工构建转座子进行的遗传物质重排现象。10.1G+a)碱裂解法抽提质粒PTV1;b)质粒PTV1的鉴定（有没有图谱？或者设计引物进行PCR扩增）;c)质粒PTV1电转至H4感受态细胞，涂布至含红霉素（0.5ug/mL）和林可霉素（20ug/mL）的BHI平板中，31℃培养，直至可见菌落（大概需两天，能在双抗平板上生长得即为阳性转化子）d)挑单菌落至BHI（红霉素，0.5ug/mL）肉汤中，31℃培养至对数生长期e)分别取步骤4中的培养液5μL、10μL、20μL和100μL加入到新鲜的5mLBHI中于41℃水浴过夜，进行转座诱导f)将41℃各培养物梯度稀释，取各稀释度涂布到分别含红霉素（0.5ug/mL）、5%卵黄BHI平板中，筛选溶脂活性消除的单菌落g)反向PCR或基因步移方法确定转座子Tn917插入的靶位点，经T-A克隆至pMD18-T载体中，送往公司测序。10.2G-a)受体菌、辅助菌及供体菌在相应选择性培养基中37℃b)菌液以1：10在对应选择性新鲜培养基中扩大培养至OD600为0.8左右；c)分别取1mL供体菌和辅助菌液混和，再取2mL受体菌与之混和；d)4000rpm离心10分钟，弃上清，扣除干净残余水分；e)用1mL0.85%NaCl或100MmMgSO4轻悬沉淀；f)4000rpm离心10分钟，弃上清，扣除干净残余水分；g)取50µlNacl或MgSO4重悬沉淀，吸出点于0.22µM滤膜上，置于1%BHI平板上37℃h)用1mLNaCl或MgSO4洗膜。取100µl涂布于选择性抗性平板，取10倍及100倍稀释的菌液分别涂布于抗性平板，同时取受体菌、辅助菌及供体菌100µl涂于抗性平板中作为阴性对照。i)37℃

11.基因步移步移技术:可以获得与已知序列相邻的未知序列，即侧翼序列.图图1基因步移的原理与策略，根据已知序列设计三条特异性引物TSP1，TSP2和TSP3，利用基因步移试剂盒（Takara）扩增已知基因侧翼的未知序列，兼并引物AP1（或AP2、AP3、AP4）与上述特异性引物进行三轮PCR反应，取前一轮的PCR反应液1μL作为第二、三轮PCR反应的模板，反应条件依试剂盒说明书。最后取1st、2rd、3rdPCR反应液各5μL，1%的琼脂糖凝胶进行电泳。11.1PCR反应体系50μL11.2PCR反应条件可采取改变退火温度来优化反应体系。

12.反向PCR反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。未知序列已知序列未知序列限制酶未知序列已知序列未知序列限制酶限制酶连接酶连接酶图2反向PCR原理示意图图2反向PCR原理示意图a)试剂盒或蛋白酶K法提取细菌的基因组DNA，反向PCR对基因组DNA的纯度要求较高；b)选取限制性内切酶进行酶切(已知序列中不含该酶切位点);c)T4DNA连接环化;d)根据已知序列设计引物进行未知序列PCR扩增，TA克隆或直接将该PCR产物（需纯化）送往公司测序。13.定点突变技术定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。13.1常规定点突变a)引物设计：该方案设计的引物与为首尾相连的一对引物。引物5端必须以G或C结尾，而突变点可置于任何一条引物，最好靠近5端。突变点突变点上游引物扩增方向上游引物扩增方向下游引物扩增方向下游引物扩增方向图3引物设计原理图图3引物设计原理图b)PCR：PCR应选用不在末尾加A的DNA聚合酶，最好选用高保真的酶，如Takara的PrimeSTAR.PCR反应的循环数最好控制在25个以内。c)PCR产物经DNA电泳回收目的片段。d)回收的片段经T4多聚核苷酸激酶在5端加磷。Components10×reactionbuffer5μLDNAtemplateDependonthevolumeafterpurificationATP1mMT4PNK1μLdH2OUpto50μL37°C作用1小时e)T4多聚核苷酸激酶作用后，酚/氯仿纯化，无水乙醇沉淀，最终溶解于30μLddH2O。f)取适当纯化后的模板连接过夜后进行常规转化。13.2大片段定点突变技术a)PCR反应体系Components10×reactionbuffer5μLPlasmidtemplatePlasmid(100ng/μL)2.0μLPrimer1Primernsp11-U1.25μL(125ng)Primer2Primernsp11-L1.25μL(125ng)dNTPmix1μLQuikSolution3.5μLdH2O35μLPfuΜLtraHFDNApolymerase1μLb)PCR反应程序SegmentCyclesTemperatureTime1195°C2minute21895°C1minute58°C50seconds68°C22minute3168°C7minutec)PCR反应结束后加入限制性内切酶DpnI(10U/μL)1μL。d)离心混匀后37°C作用1-1.5小时。e)将感受态细胞XL10-GoldμLtracompetentcells放于冰上，待其溶解后，根据样品数向每个灭菌的1.5ep管中加入45μL感受态细胞。f)再向每个管中加入2μLβ-ME，并轻弹管壁使其混匀。在冰上放置10分钟，每隔2分钟轻弹几次。g)将4μLDpnI处理的PCR反应液加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30分钟。h)42°C热激30秒，迅速置冰上放置2分钟。i)加入0.5mLSOC或LB，37°C，225-250rpm培养1小时。j)5600rpm离心6分钟，弃300μL上清，重悬细胞后涂布于合适的抗性平板。注：此方案需使用Stratagene公司的定点突变试剂盒(Cat#200522,Stratagene)，适用于对大于10kb的质粒进行定点突变、缺失及插入。引物可根据Stratagene公司提供的软件进行设计。该方案中设计的引物为反向互补的引物/tradeshows/feature.aspx?fpId=118红色字体的参数根据不同的质粒大小可适当进行调整。111）LB培养基细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取粉5gNaCl10g加950mL去离子水，加热直至完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2mL)调节PH值至7.0，加入去离子水至