持续性高危型人乳头瘤病毒感染的处理 附人乳头瘤病毒感染患者的实验室检测方法与临床干预策略

持续性高危型人乳头瘤病毒感染的处理德国科学家哈拉尔德•楚尔•豪森发现人乳头瘤病毒(HPV)是子宫颈癌的致病病毒。真实世界中HPV感染极为常见，80%以上的性活跃女性一生中会感染1个或多个型别的高危型HPV,但大多数为一过性感染，约90%HPV感染可通过自体免疫力而自然清除，并无致癌潜力。根据HPV感染与致癌性之间的关系，2012年国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC)将其分为高危型、疑似高危型和低危型三大类别。大量的流行病学研究印证了豪森的理论，即持续性高危型HPV感染才是子宫颈癌发生的根本原因。美国阴道镜及子宫颈病理协会(AmericanSocietyforCoposcopyandCervicalPathology,ASCCP)指南详细阐述了子宫颈病变与子宫颈癌的筛查流程以及子宫颈病变的分层处理、随访监测等一系列建议，遗憾的是指南并未对持续性高危型HPV感染做系统论述，乃至于持续性高危型HPV感染的定义、感染率、处理等少有提及，导致该类情况的临床处理中存在两种极端现象，即过于恐惧下的治疗过度以及重视不到位下的治疗不足。鉴于持续性高危型HPV感染的特殊临床意义，本文回顾既往已发表的相关文献，结合自身临床经验，就其定义、发生率、临床处理及预防等相关问题予以阐述。持续性高危型HPV感染：定义的分歧目前已知的HPV型别有200余种，涉及生殖道感染相关者仅40余种。常见的高危型HPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59共12个型别；疑似高危型HPV有26、53、66、67、68、70、73、82共8个型别。上述型别的HPV感染与子宫颈癌及高级别外阴、阴道、子宫颈鳞状上皮内病变相关。持续性HPV感染的定义在已报道文献中尚无统一意见。2013年Rositch等回顾86篇HPV感染的相关文献，总计涵盖10万余名女性，结果提示73%的研究支持将持续性HPV感染定义为至少2个时间节点检测到HPV阳性，而其他研究提出须至少3个时间点检测HPV阳性，但均未强调HPV的型别；41%研究认为HPV阳性持续至少6〜12个月可考虑为持续性HPV感染，相邻2次HPV检测的时间间隔中位数为6个月。纵观所有的研究，高危型HPV感染的中位持续时间为9.3个月，具体到型别上,HPV31的中位时间14.4个月,HPV33中位时间为12.5个月,HPV16中位时间为12.4个月,HPV18中位时间9.8个月。Stensen等的观点则认为，持续性高危型HPV感染定义为2个时间节点检测到同一型别高危型HPV阳性，时间间隔应＞12个月。鉴于缺乏持续性HPV感染的统一定义，毋庸置疑，子宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)治疗后持续性高危型HPV感染的定义亦无章可循。Hoffman等提出将子宫颈HSIL治疗后持续性HPV感染定义为治疗前、治疗时发现的HPV感染直到治疗后仍然存在，并据此分为3种类型：(1)持续性HPV感染：在连续2个时间点检测到任何型别HPV阳性。(2)持续性高危型HPV感染：在连续2个时间点检测到高危型HPV阳性。(3)特定分型的持续性HPV感染：在连续2个时间点检测到同一型别HPV阳性。上述的2个时间点是指基线HPV检测与治疗后首次随访HPV检测的时间,因而仍然是一个模棱两可的“定义”。Gosvig等则将子宫颈HSIL治疗后持续性HPV感染定义为治疗前后均存在同一型别HPV阳性，更未提及时间节点。鉴于目前国际上对持续性高危型HPV感染的定义存有很大的主观性，当然临床决策会有不小的分歧，因而本文仅就以英文关键词"persistent；Hr-HPVinfection”和中文“持续性；高危HPV感染”为词条所涵盖的大宗文献，抽提其中颇具代表性的观点加以阐述，所述论点难免以偏概全，恳请商榷。2持续性高危型HPV感染发生率Stensen等以2784名女性为研究目标人群，持续性高危型HPV感染率为31.4%o该研究提示25〜30岁女性感染率最高，达34.1%；随着年龄增长，持续性高危型HPV感染率呈逐渐下降态势，45〜50岁感染率降至19.6%,但年龄〉50岁女性感染率又有所回升，达到26.3%OEbisch等随访18〜29岁女性8年，高危型HPV感染率达38.6%(371/962),2年持续性感染率为30.7%(114/371),这其中19.3%(22/114)的持续性高危型HPV感染者经进一步分流检测，确诊为HSILoGosvig等对因HSIL行子宫颈锥形切除术患者进行随访，以术后第4〜6个月为第1次随访时间节点，结果发现持续性高危型HPV感染率为9.5%°Rositch等系统性回顾25篇文献，HSIL治疗后经过3年的随访，HPV阳性率为。〜47%(四分位数间距0〜15%)。Hoffman等系统性综述了45篇文献，发现子宫颈上皮内瘤变(CIN)治疗后HPV阳性率随着随访时间的延长而渐次降低，并且治疗措施与HPV持续感染有美,经子宫颈冷刀锥形切除术和子宫颈环形电切除术(LEEP)治疗者，随访12个月内HPV的清除率明显优于冷冻治疗。此外，子宫颈病变治疗后的持续性HPV感染率亦随年龄、检测技术和方法、治疗后的检测最短间隔而不同。HPV检测之于子宫颈病变筛查：一致中的“不一致”毋庸置疑，持续性高危型HPV感染是子宫颈癌发生的根本原因，然而如何进行规范运用HPV的检测，国际上不同社团存有各自的主张，亦远未臻统一。ASCCP指南提出子宫颈细胞学单独用于21〜29岁女性子宫颈癌筛查，子宫颈细胞学与HPV检测可联合用于30岁及以上女性子宫颈癌筛查，对于细胞学阴性、HPV阳性患者可进行HPV16/18分型检测进行分流管理。2015年美国妇科肿瘤协会(SocietyofGynecologicOncology,SGO)以及ASCCP等多个社团共同发布子宫颈癌筛查过渡期指南，提出高危型HPV初筛可以作为子宫颈癌筛查的替代方案。与细胞学阴性相比，高危型HPV初筛阴性预判CIN3及浸润性子宫颈癌的准确性更高。2018年美国预防服务工作组(U.S.PreventiveServicesTaskForce,USPSTF)亦提出应用单一高危型HPV筛查、高危型HPV联合细胞学筛查，二者都具有较高的CIN3+检出率。韩国妇产科协会(KoreanSocietyofObstetricsandGynecology,KSOG)和韩国妇科肿瘤学会(KoreanSocietyofGynecologicOncology,KSGO)联合发布声明支持高危型HPV初筛作为子宫颈癌的主要筛查手段，并一致推荐高危型HPV初筛适用于25岁及以上女性，每隔3年筛查1次。持续性高危型HPV感染的诊治措施持续性高危型HPV感染初始处理流程HPV16/18阳性资料统计提示70%子宫颈癌系因持续性HPV16/18感染所致。25岁以上HPV16/18阳性的非妊娠女性，无论有无细胞学结果以及细胞学结果如何均推荐转诊阴道镜检查。阴道镜检查醋酸试验无醋白上皮、无细胞化生或其他可见的异常表现，不推荐“随意性”的子宫颈活检；细胞学HSIL或阴道镜印象为高级别病变，推荐诊断性切除或阴道镜下多点活检均可，子宫颈活检无病变者12个月后复查HPV16/18有无转阴。12个月后重复检测HPV16/18阳性者，严格遵循并重复上述流程，当再次子宫颈活检证实无子宫颈病变者6个月后再进行复查。对于持续性HPV16/18感染患者，随访时间间隔定为6个月，是基于Ebisch等的研究，该研究发现高危型HPV持续性感染12〜24个月较持续3〜12个月者HSIL发生率明显升高（19.5%vs.3.1%）,持续性高危型HPV感染超过12个月，子宫颈HSIL患病率明显升高，因而以6个月为节点似乎更为妥善和安全。非HPV16/18高危型HPV阳性2015年SGO子宫颈癌筛查过渡期指南提出，对于非16/18型的其他12种高危型HPV亚型阳性女性，应根据子宫颈细胞学结果进行分流：（1）子宫颈细胞学提示无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASCUS）及以上病变，需转诊阴道镜。（2）子宫颈细胞学正常，12个月后再进行检测。12个月后复查结果如显示其他12种高危型HPV亚型阳性，按照前述流程予以分流；如阴道镜检查阴性或子宫颈细胞学正常，可6个月后随访，时间间隔定为6个月亦是基于Ebisch等的研究。此外，对于同一型别高危型HPV持续性感染应提高警惕，Castle等发现间隔9〜12个月连续2次检测高危型HPV阳性，结果为同一型别HPV者较不同型别阳性者子宫颈癌及癌前病变的发生率高（2L3%vs.17.0%）。Mittal等纳入650例高危型HPV阳性但阴道镜或（及）组织学提示无病变或仅为CIN1的女性，经过平均2年的随访，有25.6%女性呈持续性高危型HPV感染，累计6.3%发展为CIN2或更高级病变。因此，对于持续性高危型HPV感染2年但细胞学正常的患者，推荐阴道镜检查，尤其需要重视同一型别高危型HPV感染患者。下生殖道低级别鳞状上皮内病变近年来，国际外阴阴道疾病研究协会（InternationalSocietyfortheStudyofVulvovaginalDiseases,ISVVD）和美国病理学家协会（CollegeofAmericanPathologists,CAP）/ASCCP推荐使用二级分类法替代原来沿用的三级分类法，即下生殖道鳞状上皮内病变分为低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、HSILo下生殖道LSIL包括外阴上皮内瘤变1级（vulvarintraepithelialneoplasiagrades1,VIN1）、阴道上皮内瘤变1级（vaginalintraepithelialneoplasiagrades1,ValN1）和CIN1o外阴及阴道LSIL,可仅随访观察，定期细胞学联合阴道镜检查。仅仅就子宫颈上皮内瘤变而言，约50%的CIN1可自然消退，1。％进展为CIN3,只有不足2%的患者进展为浸润癌。持续性高危型HPV感染、组织病理学CIN1持续2年者，继续随访或积极治疗均可选择，但积极治疗的前提需遵循以下原则：（1）满意的阴道镜检查，治疗方式可选择诊断性子宫颈锥形切除术或消融术。（2）如阴道镜检查不充分，子宫颈管搔刮样本发现CIN2、CIN3、CIN2/3或未能分级的CIN,或有既往子宫颈病变治疗史，推荐子宫颈锥形切除术。（3）阴道镜检查不充分的前提下，不推荐子宫颈消融术。（4）子宫颈CIN1初始治疗，不推荐子宫切除术。子宫颈管搔刮样本为CIN1者，处理原则等同于子宫颈CINlo下生殖道高级别鳞状上皮内病变外阴HSIL包括VIN2和VIN3,是外阴疣状/基底细胞样鳞癌的癌前病变，常见于年轻女性。首选的治疗手段是手术切除，病变距离切缘5mm以上，深度达到4mm。其他可选择的方法包括二氧化碳激光治疗，该项技术可以保持外阴完整外观，缺点是无法获得组织学依据，无法评估有无隐匿性浸润灶；5%咪嗟莫特可避免瘢痕形成和性功能受损，适于小病灶患者。不论选择何种治疗方式以及切缘状态如何，外阴HSIL复发风险均高达30%〜40%,因此即使是经历治疗，也推荐至少2〜3年内密切随访。阴道HSIL包括VaIN2和VaIN3,治疗方法应基于病灶数量和位置，浸润癌的可疑程度，可依据现有的治疗手段、医师的技术和经验进行个体化选择，治疗手段包括激光消融、手术切除以及局部用药；局部用药包括咪口奎莫特、氟尿喀陡(5-FU)o无论是激光消融、手术切除以及局部用药，单一治疗的复发率都很高，多需综合2种或2种以上治疗手段，治疗后推荐长期密切随访。子宫颈HSIL包括CIN2和CIN3,25岁及以上非妊娠患者如阴道镜检查充分，诊断性子宫颈锥切和消融治疗均可；如阴道镜检查不充分，子宫颈管搔刮样本发现HSIL或未分级的CIN,推荐诊断性子宫颈锥切而非消融治疗；除外年轻及合并妊娠患者，均不推荐期待观察和直接子宫切除术治疗。2014年WHO推荐诊断有争议的CIN2,需进行P16基因免疫组化检测，pl6表达阳性者升级按照CIN3处理，pl6表达阴性可暂观察，VIN2与ValN2的处理原则等同于CIN2。HPV感染性疾病之特殊情况的处理ASCCP指南推荐年龄V21岁女性无论有无性生活，均无需常规进行子宫颈癌筛查。但临床实际诊疗中，对具有高危因素(性生活早、性伴侣多、既往多次流产史、不良生活习惯等)、伴有临床症状者(接触性阴道流血等)，即使年龄〈21岁也应进行常规筛查。21〜24岁女性如持续存在下生殖道LSIL,处理要相对保守，即使组织学证实为HSIL,亦不推荐即刻处理。持续性高危型HPV感染的妊娠期女性，处理方式同非妊娠期，不同之处在于禁忌子宫颈管搔刮取样。妊娠合并持续性子宫颈CIN1,仅需随访不用治疗；妊娠合并HSIL,应每12周进行1次阴道镜和子宫颈细胞学检查,只有随访中高度提示子宫颈浸润癌时,，推荐子宫颈活检或诊断性子宫颈锥形切除术，以排除妊娠期子宫颈癌。子宫颈HSIL治疗后持续性高危型HPV感染子宫颈HSIL治疗后病变复发和病灶残留的发生率为5%〜25%。ASCCP指南建议CIN2、CIN3和CIN2/3的患者在治疗后第12、24个月进行子宫颈细胞学和HPV的联合检测。李宁等随访238例子宫颈HSIL锥形切除术患者，术后第6、12、18个月分别进行子宫颈细胞学检查和HPV分型检测，结果发现HPV多重感染(HR8.6,95%CI1.8—41.7,P=0.008)和同一型别HPV持续感染(HR5.1,95%CI1.0—24.8,P=0.042)是病变复发的独立危险因素，与Strander等的结论一致。经过严格的随访，子宫颈HSIL治疗后单纯性持续性HPV阳性，ASCCP不推荐重复治疗或子宫切除术；当组织学诊断为复发性或持续性CIN2、CIN3和CIN2/3时，方可选择诊断性子宫颈锥形切除术或子宫切除术。单一持续性高危型HPV感染对于细胞学结果正常而仅仅是持续性高危型HPV感染者，是否进行医疗干预达到清除病毒的目的，目前尚是医患共同面临的困惑。Stensen等研究发现持续性高危型HPV感染与生殖器尖锐湿疣病史、长期应用避孕药或糖皮质激素有关，这直接或间接提示全身及局部免疫因素在持续性高危型HPV感染中发挥关键作用。基于免疫学说，增强局部和全身免疫力以求达到清除HPV病毒的药物层出不穷，这些药物包括阴道局部用药和全身用药等。甚至还有研究者提出活性己糖相关化合物(activehexosecorrelatedcompound,AHCC)用于调节机体免疫力可清除高危型HPV感染。上述众多药物增强免疫力疗法理论上似乎可行，但有待大规模随机对照试验获取循证医学证据，方可做出客观评价。持续性高危型HPV感染预防子宫颈癌的一级预防即接种HPV疫苗。自2006年，全球范围内已批准3种HPV疫苗以有效预防持续性高危型HPV感染引起的病变，包括二价疫苗(针对HPV16、18)、四价疫苗(针对HPV16、18、6、11)和九价疫苗(针对HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58)；WHO数据显示HPV疫苗并不存在安全性问题，并推荐将HPV疫苗接种纳入国家免疫规划，重点针对开始性活动之前的女性，尤其是10〜14岁女孩。目前，全球已有90多个国家或地区响应WHO号召，并在一些国家并取得卓越成就。2008年苏格兰即将二价HPV疫苗纳入国家免疫规划项目，12〜13岁女孩接种率高达92.4%；对这部分人群在20〜21岁进行常规子宫颈筛查时进行HPV分型分析，发现HPV16/18感染率下降89%(95%CI85.1%〜92.3%)；非疫苗型HPV31/33/45感染率下降85%(95%CI77.3%~90.9%),提示二价疫苗具有交叉保护的效果；同时，二价HPV疫苗高覆盖率对未接种疫苗群体也具有群体保护效应，未接种群体HPV16/18及HPV31/33/45感染风险分别下降87%(95%CI72%〜94%)和55%(95%CI11%〜77%)。与此相伴的子宫颈病变检出率显著下降，在12〜13岁全程接种二价疫苗的女性群体中，HPV疫苗对于CIN3及以上病变的保护效果可达86%(95%CI75%〜92%)。澳大利亚联邦政府开展HPV疫苗免费接种计划同样较早，亦取得相似结果。上述数据有力证实了HPV疫苗在预防高危型HPV持续性感染方面的效果。自2016年以来，3种疫苗陆续在我国得到批准上市，但在实际疫苗接种工作中，青少年女性接种HPV疫苗的覆盖面极其有限，这其中与低接种率有关的瓶颈问题包括认知、知晓度、价格等诸多因素，鉴于目前国产二价HPV疫苗已经上市，价格壁垒已被突破，大力推进HPV疫苗接种工作对于降低HPV感染，无疑会发挥举足轻重的作用。总之，无论是单一持续性高危型HPV感染抑或子宫颈病变治疗后的持续性高危型HPV感染，不同文献评估感染率有所不同，目前尚无统一意见和定义，从人群结构而言年轻女性感染率较高。持续性高危型HPV感染是子宫颈鳞状上皮内病变发生及治疗后复发的风险因素，同一亚型高危型HPV感染者尤甚。ASCCP对于持续性高危型HPV感染处理意见较少，未多做特别阐述。鉴于持续性高危型HPV感染实际存在的临床现象，期待更多相关有针对性的前瞻性研究及专家共识用于实际工作之中。HPV疫苗能够有效预防高危型HPV持续性感染,进而降低子宫颈鳞状上皮内病变及子宫颈癌的发生率。人乳头瘤病毒感染患者的实验室检测方法与临床干预策略患者感染HPV后，如果长时间不能自行清除，就称为HPV的持续感染。目前普遍认为高危型HPV亚型的持续感染是发展成宫颈癌的主要因素。人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)是一种无包膜的、结构为双链闭合环状的小分子DNA病毒，属于多孔病毒科乳头瘤病毒属，由一个二十面体包绕的衣壳蛋白组成基因组，由L1和L2两个结构蛋白构成，直径大约55nm［l］。HPV侵犯人体后停留于感染部位的皮肤和黏膜中，并进行增殖，不进入血液，不产生毒血症。至今已鉴定出100多种HPV基因型，经常用HPV-1、HPV-2表示，将近33%的基因型与与生殖道损伤有关［2］。在目前已经可以检测出与人体感染相关的HPV亚型，根据感染可能引起的临床后果，分为低风险亚型如HPV-2、HPV-lkHPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV5-3、HPV-54、HPV-61、HPV-72和HPV-81［3］和高风险亚型如:HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33,HPV-35、HPV-39,HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73、HPV-82等⑷。近年来，受到极大关注的是HPV感染与女性子宫颈癌的关系，并且经世界各国多年的大量研究，目前认识趋于统一。HPV癌基因亚型的新检测能够预测宫颈癌的未来发展风险。本文将就人乳头瘤病毒感染的常用检测方法、临床应用进展、以及感染后的干预策略进行具体分析。一、人乳头瘤病毒感染的检测方法HPV的检测方法包括细胞学检测、基于聚合酶链反应(PCR)原理的实时荧光定量核酸扩增检测法(FQ-PCR)、巢式PCR、利用杂交俘获试验的基因捕获DNA检测法(HybridenPtureDNAtest,HC2)、CervistaHPVHR检测法以及基因芯片技术⑸。目前,临床上常用的HPV检测方法主要有核酸分子杂交法、PCR-表面等离子谐振法以及将PCR技术和反向点杂交技术相结合的检测方法(PCR-RDB,ReverseDotBlot)。各种检测方法原理、特点及适用范围不同，分别可用于群体筛查、辅助诊断、疗效评估，科研等不同方面。表1列出了近年常用的HPV检测方法及各自不同的特点比较。表1.人乳头瘤病毒感染基因检测技术比较检测方法原理样本类型特点群体筛查1免疫组化抗体用鼠抗病毒单克隆抗体石蜡切片不能分型，特异性及敏感性较差。不适用2原位杂交法组织或细胞在病理切片上和分子探针进行杂交细胞、组织可观察组织学形态变化，又可枪测基因表达状况的理想的病理学检测及研究方法；操作较复杂，只可分为高危、低危型。不适用3PCR方法提取细胞或组织中的DNA,用商品化的HPV引物探测标本中的HPVDNA,用凝胶电泳技术分寓HPVDNA条带，可检测6、11、16、18等型HPVDNA细胞、组织在病理科、妇科实验室应用广泛；PCR产物较易污染，出现假阴、假阳性，检测亚型种类有限适用4荧光PCR方法设计高危型HPVDNA引物，应用全自动实时PCR荧光检测仪，可检测20余种高危、低危型HPVDNA细胞、组织标本易得，检测过程操作简便，结果可靠。既可辅助临床诊疗，也可用作人群大规模筛查适用5第二代杂交捕获法(HCII)利用对抗体捕获信号放大和化学发光的检测细胞学标本用于对女性宫颈癌的初筛适用6导流杂交基因芯片技术采用基因信号放大技术、导流杂交法并结合基因：DNA提取-PCR基因扩增-在基因芯片上导流杂交一显色细胞、组织检测制基因型别多达37种适用7荧光定量杂交捕获技术对HPVE6/E7制A的表达及拷贝数定量测定细胞、组织定量检测HPVE6/E7it«NA不适用二、人乳头瘤病毒感染的临床应用研究进展近年来，HPV的感染受到高度重视，在侵犯黏膜的HPV亚型中，尤其是生殖系统的HPV感染。目前发现100多种型别的HPV中有40个以上的型别与人类生殖道感染有关。表2显示了不同HPV亚型分别对皮肤、黏膜侵犯所引致患病的风险程度。表2.不同亚型的HPV在临床诊疗中的应用价叁HPV侵犯部位低危僖危HPV亚型临床常见病变侵犯皮肤•皮肤低危型HPV皮肤高危型1、2、3、4、7、10、12、15型5、8、14、17、20、36、38皮肤的疣状增生，如寻常疣、扁平疣、跖疣、甲周疣、丝状疣等皮肤的鲍温病、基底细胞癌、枝哲病、鳞状细胞癌等上皮胆痛♦膜低危型6、11、13、32、34、40、42、43、44、54、61、70、72、81可引发生殖器、肛门、口咽部、食道等部位黏膜的疣侵犯黏膜黏膜高危型16、18、30、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、26、53、76、82与宫颈癌、外阴癌、阳道癌、阴茎癌、肛门直肠癌、口腔癌、扁桃体癌