核酸的提取分离

关于核酸的提取分离第一页，共二十六页，2022年，8月28日第五章核酸的提取分离§5.1概述§5.2核酸的理化性质§5.3核酸的作用与用途§5.4动物脏器核酸的提取分离方法§5.5转移因子的制备§5.6辅酶A的提取§5.7复合辅酶的提取§5.8从啤酒酵母中提取RNA第二页，共二十六页，2022年，8月28日§5.1概述核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)碱基(base)第三页，共二十六页，2022年，8月28日组成核苷酸的碱基第四页，共二十六页，2022年，8月28日Fig.2-4TheprimarystructureofDNA.第五页，共二十六页，2022年，8月28日脱氧核糖核酸（DNA）主要存在于细胞核的染色体中，核糖核酸（RNA）主要存在于细胞的微粒体中，各种生物体含有核酸的多少不同应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，76个核苷酸，与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力第六页，共二十六页，2022年，8月28日呈味核苷酸是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为5－IMP（肌苷酸钠）、5－GMP（鸟苷酸钠）、I＋G（50％IMP＋50GMP），我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡肉、鸡蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及多种调味料复合而成。核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。

核酸在食品和药品领域中的应用？第七页，共二十六页，2022年，8月28日核酸工业的市场分析核酸药物产品的开发已有近70年历史。目前，日本是核酸产品的最大生产国，其年产量约7500吨，约占世界产量的90%；西方国家中，意大利也有核酸产品，但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要为调味品。我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，仅ATP一项每年就从日本进口金额达八千万美元第八页，共二十六页，2022年，8月28日§5.2核酸的理化性质§5.2.1核酸的一般性质1、DNA分子与蛋白质分子、RNA相对分子质量？2、DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末，均微溶于水，稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液，乙醇＞50％（w/w）时，DNA析出，当＞75％时，RNA也沉淀出来→溶解度差别分离≥106几千到百万几万到几百万第九页，共二十六页，2022年，8月28日盐溶液中溶解度差异提取RNA时NaCl盐溶液浓度仅为0.14mol/L即可而提取DNA时，需先用0.14mol/LNaCl将RNA除掉，再继续增加NaCl浓度至1mol/L时才能够将DNA提取出来第十页，共二十六页，2022年，8月28日§5.2.1核酸的一般性质3、DNA极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，pH超出时，相对黏度突然降低4、可被酸、碱或酶水解成各种组分，用层析、电泳等方法分离，主要利用：

RNA的磷酸酯键对碱敏感：室温，0.3~1mol/LKOH，24h，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。★DNA抗碱水解★生理意义：DNA更稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。第十一页，共二十六页，2022年，8月28日§5.2.2核酸的紫外吸收性质嘌呤、嘧啶环→共轭双键→紫外吸收，核酸λmax260nm附近，而λmin230nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280≥1.8；纯RNA的A260/A280≥2.0若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280↓2、含量计算，吸光值为1.00时，相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸第十二页，共二十六页，2022年，8月28日DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用OD260nm测定其浓度另一方面DNA和RNA含磷含糖，所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量RNA所含糖为核糖→苔黑酚法测定；DNA所含糖为脱氧核糖→二苯胺法测定。含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定，纯RNA含磷量为9％，而纯DNA含磷量为9.2%。第十三页，共二十六页，2022年，8月28日§5.2.3核酸的变性和复性

高温（热变性）、酸碱（pH小于4或大于11）及某些变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。第十四页，共二十六页，2022年，8月28日变性后的理化性质★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。260nm吸收值升高。★

增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。第十五页，共二十六页，2022年，8月28日熔解温度（Tm）：★DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00；完全变性（单链）A260=1.37

当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。

DNA的Tm一般在82—95℃之间第十六页，共二十六页，2022年，8月28日影响DNA的Tm值的因素1、DNA均一性：均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。2、G-C含量与Tm值成正比（why？）：测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.443、介质中离子强度：离子强度高，Tm高，范围变宽。G-C对中含有3个氢键，较A-T对中仅有2个氢键更为稳定第十七页，共二十六页，2022年，8月28日§5.2.4核酸的测定1、紫外分光光度法2、定糖法：DNA、RNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖→能与某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质（简便，定性or颜色深浅定量）RNA＋浓盐酸＋苔黑酚（3，5-二羟甲苯）共热→绿色DNA＋浓醋酸＋少量浓硫酸＋二苯胺共热→蓝色3、定磷法：DNA含磷量9.2%，RNA含磷量9％1g磷相当于11g核酸，消化后用钼酸胺定磷试剂仅测得与嘌呤连接的糖第十八页，共二十六页，2022年，8月28日4、核酸分析时样品的预处理用定磷、定糖或紫外吸收的方法测定某一生物材料中核酸或其水解物含量时，需先经预处理→去掉杂质，避免干扰1）将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆→稀三氯乙酸or1％高氯酸低温抽提几次，得到沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖等2）用有机溶剂抽提去除脂溶性磷脂等物质→不溶于酸的非脂化合物如DNA、RNA、蛋白质、磷蛋白和少量磷化合物再采用酸（5％三氯乙酸或6％高氯酸，90oC，15min，再定糖法测定）或碱处理法（37oC，0.3-1mol/LNaOH，18h，DNA，RNA能够分开）第十九页，共二十六页，2022年，8月28日§5.3核酸的作用与用途核酸作用：与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质→诸多恶性肿瘤、遗传性疾病及放射病均与核酸改变有关1、嘌呤和嘧啶类生化产品：核酸组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有良好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖，如：5-氟尿嘧啶2、核苷类生化产品：如辅酶A3、核苷酸类生化产品：如免疫核糖核酸iRNA、转移因子第二十页，共二十六页，2022年，8月28日§5.4动物脏器核酸的提取分离方法核酸及其衍生物类药物，属天然大分子，结构复杂→采用生物材料为原料的提取法制造核苷酸类及其衍生物，小分子，结构简单→化学合成法一、RNA的提取分离动物组织捣碎→匀浆→0.14mol/LNaCl溶液提取→调pH至4.5，RNA.蛋白↓，RNA与蛋白质分开的方法：1）乙醇沉淀法2）盐酸胍和去污剂分离法3）酚法第二十一页，共二十六页，2022年，8月28日二、DNA的提取分离利用核糖核蛋白在0.14mol/LNaCl可溶，而DNA核蛋白则可溶于水或高浓度的盐溶液（1mol/LNaCl）组织捣碎→

0.14mol/LNaCl反复洗涤以去除RNA（或0.1mol/LNaCl＋0.05mol/LNaCl枸橼酸钠）→去污剂SDS使蛋白质变性→沉淀用1mol/LNaCl溶解→乙醇沉淀→去污剂精制，反复多次常用去蛋白方法：含有新醇或异戊醇的氯仿沉淀核蛋白→离心；SDS；苯酚处理，离心分层提取核酸时要注意保持其完整性（防过酸、碱、低温）第二十二页，共二十六页，2022年，8月28日§5.5转移因子的制备Transferfactor（TF）一种多核苷酸和多肽小分子物质，为细胞免疫促进剂。可将供体的细胞免疫性转移给受体正常的淋巴细胞，并能促进释放干扰素。临床用于免疫缺陷的病人，如感染、疱疹、乙肝、麻疹等。对恶性肿瘤可作为辅助治疗剂；作用无种属特异性。制备TF的原料除特异性供体白细胞外，一般采用正常人血液、脾和扁桃体等原料提取工艺中主要采用透析、柱层析、超滤及加絮凝剂和助滤剂再过滤等第二十三页，共二十六页，2022年，8月28日§5.6辅酶A的提取辅酶A（CoenzymeA，CoA），是由等分子的泛酸、腺嘌呤、核糖、氨基乙硫醇和三分子磷酸构成，ADP的衍生物或类似物，相对分子量为767.54主要起传递酰基的作用，来回接受和放出酰基，携带酰基的部位在－SH上→以HSCoA表示对糖、脂类和蛋白质的代谢具有非常重要的影响，作为白细胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、功能性低热、脂肪肝、各种肝炎、冠状动脉硬化、心急梗塞等疾病的重要辅助药物第二十四页，共二十六页，2022年，8月28日§5.6辅酶A的提取分离过程