植物分子育种综述

植物分子育种综述辣椒分子育种研究进展摘要综述辣椒分子标记育种、转基因育种等方面的主要研究进展,并阐明辣椒分子育种正朝着遗传图谱信息多元化、分子育种技术高效化、分子育种理论系统化的方向发展。关键词辣椒;分子育种;分子标记辅助育种;转基因育种;分子设计育种辣椒是重要蔬菜作物[1-2]。辣椒传统育种方法在提高产量、改善品质、增强抗性等方面具有选择效率低及育种周期长等缺点,因此迫切需要辣椒育种技术的升级换代。近年来,分子育种技术在辣椒育种上逐步得到了发展。辣椒分子育种包括辣椒分子标记育种、辣椒转基因育种、辣椒品种分子设计育种3个方面。辣椒分子育种将使以表型选择为主的传统育种转变为对基因型的直接、准确、高效选择,从而实现育种效率的大幅度提高。笔者对辣椒分子标记辅助育种、辣椒转基因育种研究进展进行综述,分析发展趋势,探讨有机整合方式,为我国辣椒分子育种研究的发展提供参考。辣椒分子标记育种1.1辣椒分子遗传图谱随着分子标记的不断发展和图谱研究的不断深入,辣椒图谱的饱和度也在随着增加。目前国内外已构建了20余张辣椒分子遗传图谱,根据其来源可将辣椒图谱分为种间杂交和种内杂交图谱。1.1.1种间图谱种间图谱多态性较丰富,适合做高饱合图谱。Tanksley等利用CA50(C.annuum)@CA4(C.chinense)BC群体和RFLP标记,构建了1张包含19个连锁群、85个RFLP标记的图谱[3]。此后,其他的研究者陆续采用各种DNA标记技术,基于越来越大的种间分离群体,使图谱的饱和度不断增加。迄今为止,至少报道了6张以上来源于种间杂交的分子遗传图谱,包括来源于C.annuum与C.chinense的种间杂交群体和C.annuum与C.frutescens的种间杂交群体[4]。1.1.2种内图谱种内图谱的多态性标记相对较少,但对辣椒育种意义更大。辣椒的种内图谱主要来源于C.annuum的种内群体。Lefebvre等基于Yolowonder@Perennial的DH群体,构建了1张包括14个连锁群和85个标记、总图距820cm的遗传图谱,平均标记间距9.6cM,并将4个连锁群同染色体对应[5]。Lefebvre等以2个DH群体(H3@Vania,Pe-rennial@Yolowonder)和1个F2群体(Yolowonder@CriollodeMorelos334)构建了3张连锁群分别为20、26、18个的种内遗传图谱,3张图谱分别包括534、594、186个分子标记,图谱的总跨度分别达到了1513、1688、685cm,平均标记间距13.0、12.5、13.7cm,完成了6条连锁群与染色体的对应;通过这3张图谱的分析,形成了1个包含100个功能基因标记和5个农艺性状位点的一致性图谱[6]。张宝玺等基于DH群体,构建了1个包含43个AFLP标记、8个连锁群的图谱[7]。Wang等利用123个单株的重组自交系构建了1个包含171个AFLP标记,共13个连锁群,总跨度923.5cM的辣椒种内遗传图谱[8]。曹水良等以辣椒属长椒变种的2个自交系的F2代群体为材料,利用RAPD构建1张含有28个RAPD标记,由11个连锁群组成的辣椒分子连锁图谱[9]。图谱整合2004年,以色列、美国和法国的12名研究者整合了6张图谱的信息,共同发表了1张相对完整的辣椒图谱,该图谱包含了6个群体、2262个分子标记,总跨度832cm,平均标记间距0.8cm,该图谱可望为辣椒的分子标记辅助聚合育种提供重要参考[10]。1.2辣椒重要性状基因的标记和定位1.2.1辣椒抗病虫基因及与果实性关相关基因辣椒上已经命名的基因有292个[11]。辣椒的病虫害比较多。近年来辣椒抗病基因的遗传定位发展很快,利用部分抗源材料,抗病毒病、疫病、疮痂病、白粉病及线虫等的基因相继得到了定位。辣椒果实相关性状多数是由多基因控制的数量性状,最近对其遗传定位的研究比较多,主要集中在果色、果实大小、果实形状、单果质量、辣味等方面[12]。1.2.2辣椒雄性不育基因目前报道的辣椒的雄性不育有2种,一是细胞核雄性不育,另一种是胞质雄性不育。Zhang等采用BSA分析F2群体(21号牛角椒@湘潭晚),找到2个稳定重复性好、与辣椒雄性不育恢复主基因连锁的RAPD分子标记,这些标记对主效恢复基因辅助转育有一定帮助[13]。Kim等采用RT-PCR技术扩增了辣椒雄性可育系和CMS胞质不育系的线粒体基因atp6,并对编码区及5c、3c端进行了测序[14]。张宝玺等将控制辣椒胞质雄性不育恢复性的QTLs初步定位到第1、3、6、8个连锁群上;王立浩等在此基础利用DH分离群体,通过分析育性的分离情况,评价了CMS的遗传规律,得出恢复性受主效基因和4个微效基因控制的结论,并将主效基因定位在P6染色体上[15]。唐冬英等2004年通过RAPD-BSA分析法,找到了1个与辣椒细胞质雄性不育恢复系8001中的恢复基因紧密连锁的RAPD标记OPL09-763。1.3辣椒分子标记育种实例分子标记在辣椒重要性状基因定位、育种材料筛选方面取得了显著成绩,但在抗病材料转育和新品种培育方面获得成功的报道还不多。Thabuis等利用分子选择的方法将4个抗疫病的QTL从辣椒中转入了甜椒Yolowonder,提高了Yolowonder的疫病抗性,并采用遗传背景的选择,在BC3代已经收到良好的效果[16]。王立浩等利用CAPS标记,将pvr4基因从/CdM3340向5个自交系770130、75-7-3-10、830770、830780、83-1630中转育,在BC1群体中分别检测出含有抗病连锁标记的单株21、15、10、11、12株,选择的准确率97%~98%,有4个群体经卡平方检测符合1B1[17]。说明分子标记辅助选择不仅提高了国内优良辣椒材料的抗病性,还加快了育种进程。王立浩等利用AFLP、SCAR和CAPS标记在辣椒材料Perennial0和Yolowonder0组成的BC2和BC1S1分离世代对抗PVY的3个QTLs位点进行选择。BC2群体经过CAPS标记的选择得到了在主效QTL上47个杂合位点的单株,52个纯合位点的单株。在47个杂合位点的单株中,检测到25个位于LG9PY2的含有抗性位点的单株。再经过AFLP标记对QTLLG1lP10的选择,只有11株含需要抗病位点的杂合型。BC1S1群体经SCAR标记筛选得到55株纯合抗性位点,再经CAPS标记筛选得到12株在主效QTL上纯合抗性位点的单株[18]。2辣椒转基因育种2.1转基因方法辣椒遗传转化不仅是鉴定基因功能的重要手段,也是培育辣椒新品种的重要途经之一。Liu等在1990年首次报道用农杆菌介导对辣椒进行遗传转化的结果,获得了冠瘿瘤[19],但未获得转基因植株。华南农业大学雷建军教授领导的课题组在辣椒遗传转化研究方面开展了大量的工作,取得了丰硕的成果[20]。随着更多的目的基因被分离出来,转基因辣椒也越来越多。辣椒转基因所用的方法包括农杆菌介导法、电激法、花粉管道法、基因枪法等,其中农杆菌介导法应用较多。导入的外源基因分为抗病基因、抗虫基因、抗除草剂基因、耐盐基因等。2.2转抗病毒蛋白基因在抗病基因工程中,抗病毒基因工程进展最快,取得的成果最多,尤其是在通过导入病毒外壳蛋白基因获得抗病毒的转基因植株方面,有很多将病毒外壳蛋白基因导入辣椒的报道。Murphy等报道,用电激法转化将辣椒斑驳病毒和CMV病毒外壳蛋白基因转入5个辣椒品种的原生质体,成功获得了转基因辣椒[21]。周钟信等、Yu分别将CMVcp基因转辣椒中,结果CMVcp基因都已经整合到辣椒基因组中。毕玉平等在构建了TMVcp、CMVcp双价表达载体和建立辣椒高效转化体系的基础上,用农杆菌介导法转化了农大40号0和/湘研l号0,都分别获得了转基因植株[22]。李华平等将黄瓜花叶病毒衣壳蛋白(CMVcp)基因用农杆菌介导法转入华椒17号,进行PCR、Northernblot杂交和DAS-ELISA检测[23]。郭亚华等用CMV和TMV的外壳蛋白基因构建双价载体,获得了抗CMV和TMV的转基因植株。商鸿生等用CMV和TMV的cp基因转化了线辣椒优良品种陕82120,并研究了抗卡那霉素和抗黄瓜花叶病毒特性的遗传传递规律。董春枝等将CMV卫星RNA互补DNA导入到辣椒,获得了抗病性有所增强的转基因植株[24]。2.3转抗真菌、细菌病基因辣椒转抗真菌病基因研究相对较少,Kim通过农杆菌将RIP基因转入辣椒获得了14个再生植株,检测证明再生植株都含有该基因,并且都可以遗传[25]。目前已知的抗细菌的基因主要有抗菌肽类(CecropinA,B,D等)、溶菌酶类和抗菌蛋白类,其中以昆虫抗菌肽类基因工程研究最多、发展最快。张银东等用农杆菌介导法将抗菌肽基因CecropinB、CecropinD导入辣椒品种/雪峰0中,获得了再生植株,经PCR和Southern杂交检测表明目的基因已经整合到辣椒核基因组中[26]。李乃坚等则将昆虫抗菌肽B、D基因构建而成的双价质粒pCDBÒ以农杆菌为介导转入到5个辣椒栽培品种(早丰l号、徐椒l号、苏椒2号、农丰4号等),共获得卡那霉素抗性植株1200多株,对部分卡那霉素抗性植株进行点杂交、PCR、Southern杂交检测,结果证明外源基因被成功整合[46]。盆栽接青枯菌试验结果显示,转基因植株具有较强的抗病力。李颖等在获得转抗菌肽基因辣椒后,对后代经过多代定向选育,获得了遗传稳定的抗青枯病的辣椒株系[27]。2.4转抗虫基因目前应用广泛的抗虫基因主要有Bt基因、CoTÑ(豇豆胰蛋白酶抑制剂基因)和植物凝集素基因等。柳建军等将CoTÑ基因转入/益都羊角椒0中,对获得的33株卡那霉素抗性再生植株进行了PCR检测,证明有6棵为转CoTÑ基因植株[28]。王朋等也将CoTÑ转入辣椒,经过Southern杂交初步证实该基因已整合到辣椒基因组中。袁静等通过农杆菌介导法将杀虫结晶蛋白基因crylAe导入到辣椒子叶外植体中,经卡那霉素筛选、组织化学法检测GUS活性以及PCR、Southern杂交分析,证实crylAe基因已整合到辣椒核基因组中[29]。2.5转抗除草剂、耐盐基因研辣椒转抗除草剂、耐盐基因研究报道不多,Tsaflaris通过农杆菌LBA4404将带有pat基因的质粒pKBl6.41导入辣椒,试验结果表明,转基因辣椒能够耐受0.44%浓度的商品除草剂Basta(含20%膦丝菌素),对PPT的耐受能力大大提高。林栖凤等利用自花授粉后形成的花粉管通道将海岸耐盐植物红树总DNA导入辣椒,其后代的耐盐性明显增强,在海滩上试种,用海水直接浇灌,约55%的转化株能开花、结果,而对照株全部死亡[30]。进行蛋白质SDS电泳和RAPD分析,分别发现1条1715kD蛋白质和1条111kbDNA的特异性谱带,表明通过花粉管通道导入外源DNA是可行的,其后代植株耐盐能力提高与基因组变异有关。辣椒转基因育种虽然取得了很大的成绩,但仍有不少问题需要进一步解决。辣椒基因型的差异大,有些基因型得不到再生植株。辣椒再生过程中,辣椒芽的分化比较容易,但芽的伸长存在一定的困难,转化频率低。另外,迄今为止,导入辣椒中的基因主要是病毒外壳蛋白基因,但抗病性不是很强,有些只是病情指数稍低,或者发病时间推迟。抗虫基因和其他基因的表达也大同小异[31]。3辣椒分子育种发展趋势探讨3.1辣椒遗传图谱趋于多元化目前辣椒分子遗传图谱的标记多为RAPD、RFLP、AFLP等标记,标记的种类比较单一。应利用高重组率的分离群体,开发一些稳定的、易于操作的标记,如SSR、SNP等标记,以建立标记分布均匀、饱和的分子标记连锁图谱,找到与重要性状基因紧密连锁的分子标记,为分子标记辅助育种和基因克隆服务;通过比较基因组的方法,可以利用番茄、马铃薯图谱上的分子标记丰富辣椒的遗传图谱。整合已构建的分子标记连锁图,并建立比较图谱,同时,将不同图谱中连锁群与12条染色体对应起来,以便相互借鉴,加快研究的进程[32]。3.2辣椒分子育种趋向高效化辣椒分子育种的广泛应用需要高效的分子育种技术,利用分子标记选择能有目的地将多个基因转到优势品种中。在分子标记辅助育种中,除重视单个基因位点的作用外,应考虑不同基因等位基因的作用、基因与基因的互作、基因与环境的互作等;在选择效率方面,建立不同基因的集成检测,尤其是针对不同育种亲本材料和不同性状基因的综合检测方法研究;根据不同育种目标建立配套的选择策略。转基因育种则正由单基因转化向多基因转化转变,同时,关于提高转化效率、定点整合、无筛选标记基因、规模化筛选等也是转基因研究的热点。分子设计育种是作物分子育种的理想,它可以实现从传统的经验育种到定向、高效的精确育种的转化,通过各种技术的集成与整合,对生物体从基因到系统不同层次进行设计和操作[33]。虽然辣椒分子设计育种还是新概念,且相关的信息系统不够完善,但假以时日分子设计育种、集成传统育种方法、现代生物技术、信息与工程化技术等使辣椒分子设计育种研究朝数字化设计与模拟、程序化试验和工厂化生产的方向发展。3.3辣椒分子育种理论系统化辣椒分子育种是多个学科的有机整合,随着科学技术的进步,仅仅依靠单个学科理论的简单集成已远远不能满足辣椒分子育种发展的需要,通过对大量研究成果的进一步深化发展来指导高效育种的分子育种理论体系,包括基因发掘和应用、亲本及后代选择、品种设计理论等,已成为必然趋势[34]。在亲本及选择方面,仅仅考虑性状或基因型互补是不够的,基因与基因互作、基因与环境互作等因素也不可忽视,尤其是对辣椒基因组的深入了解,使基因组学和表型组学等多个角度考虑选择成为可能。在品种设计方面,如何构建品种设计系统,使易受环境影响的随机农业变为可操控的数字化、流程化的工业体系,是未来品种设计理论发展的核心[35]。4展望辣椒分子标记辅助育种、辣椒转基因育种和辣椒品种分子设计育种三者之间是有机联系的,都是以基因为核心。分子设计育种的实现必须综合利用转基因育种与分子标记辅助育种[36]。为了突破分子育种尚不能广泛应用的限制,在重视基因研究的同时,分子育种家还需要整合不断增长基因组学和生物信息学的知识。同时,还需要考虑到由于分子育种的巨大经济效益使培育品种的结构正在发生变化,重视其应用效果的评估。但还应清楚地看到,分子育种的发展离不开常规育种,而且在今后相当长的一段时间内,常规育种方法在辣椒品种选育中将起重要的主导作用。然而,辣椒分子育种正在并将在辣椒育种中发挥越来越大的作用。参考文献[1]邹学校.中国辣椒[M].北京:中国农业出版社,2002:1-60.[2]徐小万,李颖,王恒明.中国辣椒工业的现状、发展趋势及对策[J].中国农学通报,2008,24(11):332-338.[3]TANKSLEYSD,BERNATZKYR,LAPITANNI,eta.lConservationofgenerepertoirebutnotgeneorderinpepperandtomato[J].ProNatlAcadSc,iUSA,1988,85:6419-6423.[4]PRINCEJP,POCHARDE,TANKSLEYSD.Constructionofamolecularlinkagemapofpepperandacomparisonofsyntenywithtomato[J].Ge-nome,1993,36:404-417.[5]LEFEBVREV,PALLOIXA,CARANTAC,eta.lConstructionofanin-traspecificintegratedlinkagemapofpepperusingmolecularmarkersanddoubledhaploidprogenies[J].Genome,1995,38:112-121.[6]LEFEBVREV,PFIEGERS,THABUISA,eta.lTowordsthesaturationofthepepperlinkagemapbyalignmentofthreeintraspeeificmapsincludingknown-functiongenes[J].Genome,2002,45:839-854.[7]张宝玺,王立浩,黄三文,等.辣椒分子遗传图谱的构建和胞质不育恢复性的QTL定位[J].中国农业科学,2003,36(7):818-822.[8]WANGLH,ZHANGBX,LEFEBVREV,eta.lQTLanalysisoffertilityrestorationincytoplasmicmalestrilepepper[J].TheorAppliGene,t2004,109:1058-1063.[9]曹水良,胡开林,王得元.RAPD标记构建辣椒分子连锁图谱研究初报[J].广东农业科学,2005(2):35-38.[10]PARANI,VANDERVOORTJR,LEFEBVREV,eta.lAnintegratedge-neticlinkagemapofpepper(Capsicumspp.)[J].MolecularBreeding,2002,13:251-261.[11]WANGDY,BOSLANDPW.ThegenesofCapsicum[J].Hortscience,2006,41(5):1169-1187.[12]CHAIMAB,GRUBERC,LAPIDOTM.IdentificationofquantitativetraitlociassociatedwithresistancetocucumbermosaicvirusinCapsicumann-uum[J].TheorApp1Gene,t2001,102:1213-1220.[13]WANGLH,ZHANGBX,LEFEBVREV,eta.lQTLanalysisoffertilityrestorationincytoplasmicmalestrilepepper[J].TheorAppliGene,t2004,109:1058-1063.[14]唐冬英,邹学校,刘志敏,等.辣椒胞质雄性不育恢复基因的RAPD标记[J].湖南农业大学学报:自然科学版,2004,30(4):307-309.[15]TBABUISA,PALLOIXA,SERVINB,eta.lMarker-assistedintrogressionof4PhyophthoracapsiciresistanceQTLallelesintobellpepperline:vali-dationofadditiveandepistaticeffects[J].MolecularBreeding,2004,14(1):9-20.[16]王立浩,王萱,张宝玺,等.利用CAPS标记辅助辣椒PVY抗性基因PVr4转育的研究[J].辣椒杂志,2006(4):1-4.[17]WANGLH,ZHANGBX,CARANTAC,eta.lMolecularmarkersassistedselectionforthreeQTLsresistanttoPVYinpepper(CapsicumannuumL.)[J].ActaHorticuturaeSinica,2008,35(1):53-58.[18]LIUW,PARROTTWA,HILEDEBRANDDF,eta.lAgrobacteriumin-ducedcrowngallformationinbellpepperandformationofshoot-likestructuresexpressingintroducedgenes[J].PlantCellReports,1990,9:360-364.[19]石丽,雷建军,等.中国商陆抗病毒白基因的克隆及转化辣椒[J].园艺学报,2008,35(6):847-852.[20]MURPHYJF,KYLEMM.IsolationandviralinfectionofCapsicumleaf[J].PlantCellReports,1994,3(7):397-400.[21]毕玉平,单蕾,王兴军,等.抗TMV+CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定[J].华北农学报,1999,14(3):103-108.[