四川地区紫花苜蓿真菌病害

职称论文目录TOC\o"1-3"\f\h\z\u15475第1章文献综述 1105381研究意义 1153932四川地区概况 145062.1四川地区自然地理概况 1227842.2四川牧草种植的重要性 247503四川牧草种植所面临的问题和困境 3166604国内外牧草病害研究进展 4175704.1植物真菌病害 4272744.2真菌分类系统的发展 533994.3国内外牧草真菌病害的研究进展 6136035植物病害对植物的影响 825864第2章四川地区牧草病害调查鉴定 1061091材料与方法 10197151.1调查时间和地点 10176811.2调查方法和鉴定方法 10217842调查结果 12164802.1调查的牧草种类 12247312.2调查结果 1232036第3章结论与讨论 1714191四川地区紫花苜蓿病害的调查 17675参考文献 1910098附录 22职称论文PAGE22第1章文献综述1研究意义四川盆地作为全国农业生产基地之一，由于人口与耕地面积的矛盾导致了四川可耕地资源相对较为贫乏，所以为了有效的缓解这种矛盾，加强牧草的种植越来越受到重视，这样可以有效的防治水土流失保护旱涝地，合理地调整畜牧业的结构，从而也增加了农户的收入，丰富了四川地区生物资源[1]。由于牧草及天然草地大面积的扩大，种植面积越来越广，牧草种子生产地区越来越多，这就使得牧草上面的病原菌得以有利的条件大面积爆发并迅扩散，使得牧草的产量受到了极大的损失，牧草的品质严重的损坏。牧草病害它是由病毒、真菌、细菌等外源微生物侵入到牧草体内或者环境因素的影响引起牧草生理上的异常并最终导致牧草形态上的病变的过程。根据最近几年对牧草病害调查情况来看，发生在牧草上面的常见病害有:锈病，白粉病，霜霉病，菌核病，褐斑病，菟丝子病害等[2]。在四川地区，人工草地面积的不断扩大，牧草的种质资源也得以丰富，这也使得牧草上面的病害种类越来越多，危害情况越来越严重，造成了大量的草种及鲜草产量损失及品质下降[3]。近几年国内在牧草病害方面取得了一些研究进展，许多地区都开展了对牧草病害的研究。目前国内主要是集中在病害调查方面的研究，其中有许多关于主栽牧草品种病害的调查的相关文献发表[6－9]，然而四川作为一个牧草资源丰富，具有独特的气候差异的地区，在对牧草病害调查方面的研究还比较空白，所以我们有必要系统地对四川地区各地牧草病害加以调查及对牧草病原真菌的收集，摸清四川地区各种牧草病害主要是常见病害发生及发展规律，从而为病害的防治以及生物资源的收集提供帮助，为下一步进行抗病选育，引种，驯化合理栽培管理提供一些有意义的指导。2四川地区概况2.1四川地区自然地理概况四川位于我国西南部，是一块接近菱形的盆地，它是我国四大盆地之一，其地处于我国长江的上游，其方位是在东经的101°55′至110°12′之间，处于北纬的27°39′至32°56′之间，其总的领土面积达到17万km2，盆地四周山地海拔面积多在1000m到3000m之间，盆地地势较低，并且平整，土质肥沃，其海拔在200m至750m之间，现在分属于四川和重庆两个省市。其耕地面积在493万hm2，占总面积的四分之三，现有人口总量为8041万人(据2010年人口调查数据)，人平均耕地面积为0.053hm2。现在有7100多万农业人口，每人平均经营的土地面积只有0.2hm2。四川盆地内地形极为复杂，有山脉、丘陵、平坝，其中以盆地中部的方山丘陵为主，占总面积的62%，平坝的面积仅为9%，而山地面积居中，约为29%，由于长江横贯盆地南部，使得该地成为我国重要的粮食生产基地，但该地区由于高度垦伐养殖，生态环境较差，由上面数据可以看出，该地人地面积矛盾较突出，从而导致了四川地区农业较为落后，农民增收十分困难[1]。因此，在调整农业结构与农业产业化的前提下，保护旱地，加强土地的综合生产都将使农业发展，农民增收意义重大，同时也有效地保障了我国长江上游粮食与生态安全。四川盆地属于亚热带季风气候，夏季高温多雨，冬季温和少雨，四川气候有以下一些显著特点：四川区域性差异特别大，其光热水量的差异极为不均衡，山地气候垂直变化显著，气候类型极多，局地气候千差万别，有的基本无冬，有的冬长无夏，气温年变化小，季风气候特点明显，秋雨比春雨多，多夜雨，年平均温度最高的区域可达20℃，最低的在0℃以下，区际温差达20℃以上，而与同纬度长江中下游的14-18℃的4℃区际温差相比，差异显著。从日照来看，也表现极不均衡的情况，该地云多雾重日照少，年日照时数大部分地区小于1400h，最少者不到800h，而在高原及海拔较高的地区日照数在2200℃小时，与长江中下游1600-2200h的差距相比要大得多。从降水量来看，年降水量最多的区域在1700mm以上，最少雨区却不足400mm，比其长江中下游地区的1000-1800mm的800mm区际差异相差比较显著。四川地区总积温比长江中下游地区要高出许多，由于四川盆地的封闭致使四川盆地的年日照量，常年风整等偏低，一般东部是在5月到6月多雨7月至8月高温干旱，西部4至5月春旱，7至8月降雨量较多。2.2四川牧草种植的重要性牧草是天然的优质饲料，由于牧草具有柔软多汁，木质素含量少，适口性好，消化率高的特点使得牧草适合喂养牛、羊、猪、兔、鱼等多种食草性动物，种植牧草可以提高四川丘陵地区的土地利用率，缓解饲料供应，增加农民收入。2.2.1种植牧草提高了种养业的效率由于四川地区畜牧业发达，而畜牧以种粮为主，造成人畜争粮的局面，所以采用粮草混作模式不仅可以作为畜牧业优良的饲料，而且可以促进农牧业保持稳定发展。2.2.2牧草种植有效防止水土流失四川丘陵主要为旱坡地，过度开垦为耕地过后，造成保护层破坏，所以种植牧草可以迅速提高地面植被覆盖，使土地免受侵蚀，从而能够起到保护水土流失的作用。2.2.3牧草种植提高了农户收入单一的种植限制了农业经济的发展，近年来草畜牧业成为了农民增收的主要方式，提高了农民生活水平。据马建萍研究报道认为，种植苜蓿每hm2所获得的收益是玉米的5.5倍，红苕的2.6倍，小麦的3倍，如果将苜蓿加工成干草外销出口或用于生产饲料所获得的经济效益更高[10]。2.2.4牧草种植提高了生物多样性四川地域广阔，其气候条件也决定了四川资源丰富，形成了极为复杂的生态环境，通过优良牧草的种植从而改善了为了追求经济效益而出现的种植品种单一的问题。3四川牧草种植所面临的问题和困境四川省是我国一个农业大省，它的畜牧业、养殖业经济最为发达，这就使得四川牧草成为了四川畜牧业经济的根本。近年来，土地大量开发、占用造成了农耕用地破坏减少，也就是使得四川地区多处牧草生产基地遭到破坏或者退化，然而造成四川牧草退化的一个重要因素是牧草病害，一旦牧草发生了病害就会大面积的暴发，从而许多牧草地的破坏会产生大面积的影响，不仅仅影响了牧草的质量和产量更重要的是影响了牧草的品质。感病牧草往往会使得品质下降，变得更为低劣，如牧草的有用牧质粗蛋白质含量，脂肪可溶性糖含量都会下降，相应的一些粗纤维，酚类、单宁的含量却明显增加，这样就会使得牧草的消化率下降，从而也降低了牧草的适口性。更为严重的是有些牧草病害的带病菌草种或者草还可能会带入人畜体内对人畜产生严重的影响，如禾本科牧草的麦角病就会侵入到人和动物的体内，它能在寄主体内产生生物碱，这种牧草能造成人畜早产甚至流产，还可能造成肢体坏死，肌肉发生痉挛，早在中世纪的欧州的就发生过麦角病中毒，并造成大流行的事件。还有些牧草病害能够使豆科牧草如苜蓿，草木栖中的类黄酮、香豆醇类的雌性激素增加，会抵制了母畜受孕及排卵从而减少了畜种数量。4国内外牧草病害研究进展4.1植物真菌病害我国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产将关系到我国国计民生及社会稳定，而一直以来植物病害就是农作物丰产优质高产的重要限制因素之一。据报道估计，全世界主要农作物每年的平均损失率约为总产量的10%至15%之间，这表明，每年因为植物病害的所造成的经济损失将高达数千亿美元之多。而在植物病害中，有70%至80%左右的病害是由病原真菌引起的。真菌广泛地分布在自然界中，几乎各个角落，并且其种类繁多，已描述的就有1000多种真菌引起植物的病害。在历史上多次大面积病害爆发已得到验证：比如由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病造成爱尔兰大面积马铃薯产量损失使得爱尔兰人举家迁移。稻平脐蠕孢菌引起的水稻胡麻叶斑病等都造成过大面积的破坏。所以，以真菌为主的植物病害不仅仅影响了农作物的生产造成农作物产量损失，更重要的是会影响到农作物的质量和品质，更有些病原菌可以通过腐生或者寄生的方式也会在农作物的贮藏和运输中产生影响及危害，所以作为植物病害中的主要病害，真菌病害引起了高度重视。根据Ainsworth的分类系统，把植物体病原真菌分属在子囊菌亚门、接合菌亚门、鞭毛菌亚门、担子菌亚门、半知菌亚门5个亚门，它们都分属于真菌门中，但接合菌亚门相比其他四个亚门病原真菌较少，病原真菌类群主要分布在接合菌外的其余四个亚门中。真菌病害相比细菌、病毒等病害体积较大，一般真菌病害发生的时期，它们的孢子、真菌的菌丝以及由孢子与菌丝等形成的菌索、菌核、假根、子座等变态结构用肉眼能清晰看到。真菌病害的发生与很多因素有关系，除了温度，光照，温度等主要限制因子而外：如农作物田地间栽培管理方法和措施，其他生物因子也是真菌是否滋生和传播的关键因素。由于目前病害方面的防治方面主要是针对真菌病害，真菌病害防治通常使用药剂防治，这种方法一方面造成农药残留，严重污染环境，另一方面由于真菌产生的抗药性，从而加大了真菌病害的防治难度。因此加强对真菌病害的发生规律，病害的发生条件的研究，病害的诊断及预测，植物病原菌的致病机理及寄主植物的抗病机理，以及植物抗病品种的选育等研究是植物真菌病害防治的关键方法。4.2真菌分类系统的发展真菌被人类认识利用以来，在西方已有长达3500年历史，而在我国有了6000年历史之久，但是分类系统的产生和发展才200年左右。1729年，Micheli利用显微镜研究真菌并提出了真菌分类检索表。1735年林奈将真菌分为了10属。这些工作是真菌研究的起点，并利用林奈的双命名法对真菌分类学的发展起了巨大的推动作用。依据林奈的两界法，很长一段时间真菌被归为植物界。而现代的分类学家将真菌分为一个单独的界，即真菌界，真菌界下又设有真菌门和粘菌门。真菌分类学者们依据不同的观点建立了许多不同的分类方法。近30多年来就出现了有10多种分类系统，其中有几个被普遍接受的分类系统如：贝塞在1950年将真菌界又划分为粘菌类、半知菌纲、子囊菌纲、藻状菌纲以及粘菌类；惠特克于1969年又在真菌界下设立双鞭毛亚界、真菌亚界、裸菌亚界三个亚界，真菌亚界下又设立了无鞭毛分支和后鞭毛分支，在无鞭毛分支下又划分子囊菌门、接合菌门、担子菌门。安斯沃斯（Ainsworth）在1971、1973年在真菌界下设立粘菌门、真菌门两个亚门。并将藻状菌划分为鞭毛菌和接合菌，并将原来属于真菌的几个大纲，在门下升级为亚门，有如下鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门5个亚门。马古利斯（1974）设立的分类系统把粘菌排除在真菌之外，并将地衣包括在系统内，直接设立地衣菌门、半知菌门、担子菌门、子囊菌门及接合菌门。亚历克索普罗斯（Alexo-poulos）于1979年设立的分类系统将真菌界分为粘菌门和真菌门两大类。又将真菌划分为鞭毛菌门和无鞭毛菌门，前者又分为单鞭毛菌亚、双鞭毛菌亚门；后者又分为合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门、半知菌亚门。阿尔克斯（1981）分类系统设立粘菌门、壶菌门、卵菌门和真菌门；而后者又划分为6个纲：接合菌纲、内孢霉纲、焦菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲。理想的分类系统要正确的反映真菌的亲缘关系及进化趋势，虽然在众多的分类系统还没有确立出被世界公认的确定合理的分类系统，但大多数人认为安思沃斯和亚历克索普罗斯二人的系统较为全面，又反映了新进展的内容。本文主要采用安思沃斯分类系统，将真菌划分为5亚门、18个纲、68目[12-15]。4.3国内外牧草真菌病害的研究进展牧草病害，尤其是牧草真菌病害越来越受到国内外广泛关注。在国外如美国、澳大利亚、前苏联、挪威、加拿大等国家有专门的牧草研究机构，并且开展了一系列牧草病害研究工作，尤其对一些牧草主要病害进行过系统的研究和报道，也取得了较大的进展，为牧草病害的研究和牧草抗病品种选育提供了宝贵的资料。然而国内由于缺乏牧草或者草坪草专门的研究机构，导致国内牧草病害研究较为落后，在20世纪80年代以前，国内牧草病害调查往往是和草原站或者草种机构选育等工作联系在一起进行，由于没有专门的研究机构，专门的研究人员导致我国牧草病害的调查及研究工作环节比较薄弱，我国最早出现牧草病害调查是在20世纪50年代刘经芳在其引种葡中做过牧草病害的调查；国内对牧草病害调查最多的一次系统调查是发生在20世纪60年代，戚佩坤等人在《吉林省栽培植物真菌病害志》中，记载了发生在56种牧草的160多种真菌病害。同一时期，张翰文等在《新疆经济植物病害名录》中，也有关于牧草病害的记录[11]。刘若等在20世纪70年代至80年代对天祝草原病害进行了系统研究，并在金强河进行了真菌牧草病害系统调查研究[16-19]。俞大绂于1955年对镰刀菌[20]，姜广正（1955）[21]对中国禾本科植物上的蠕形菌，王云章（1964）[22]中国黑粉菌一书中有对禾本科牧草黑粉菌，殷恭毅与杨志胜等（1986年）[23]在中国霜霉属书中，郑儒泳与余永年（1987）[24]在中国真菌志白粉菌目中都展开了全国范围的调查研究，均有对禾本科牧草病害的相关报道。20世纪80年代，我国的草坪草种类逐渐增多，草坪面积及人工牧草栽培面积不断扩大，导致牧草病害发生越来越严重，为牧草鲜草的生产及种子的培育都带来了极为严重的损失，所以这一时期的牧草病害越来越受到国内相关机构及研究人员的重视，开始了我国牧草病害的研究，但大多数仍在进行牧草病害调查。候天爵等(1980-1987)[25-27]对内蒙、甘肃、宁夏及辽宁西部地区（沙丁旺）主要牧草病害进了调查；（1986年）[28]不同苜蓿品种对褐斑病抗性进行了研究；(1993年)[29]对我国北方草地病害进行了调查，并在调查和试验的基础上提出了综合防治策略。赵桢梅与马占鸿（1994年）[30]提出了一个牧草病害田间重叠侵染的计算机模拟模型一-GDRICM。马占鸿，李克昌，武新等（1994年）[31]通过对宁夏草原的自然条件，并结合图、文、表方面进了此次调查，首次全面系统地为宁夏提供了较完整的牧草病害调查资料，填补了宁夏在此区域的空白从而为本区乃至全国提供了宝贵的资料。商文静（1992－1995）[32]调查了宁夏人工栽培的紫花苜蓿病害叶部病害发生及分布情况。苏生昌等在1997年通过重点区域调查，采用定点定期的方法调查研究了苜蓿褐斑病发生、危害及分布情况[33]。南志标与刘若等（1997年）[34]对我国江苏淮阴、北京平谷、内蒙古库伦旗、陕西吴旗、甘肃武威对不同年龄阶段的沙丁旺进行了病害调查，并认为沙打旺植株田间发病率随草地年龄而增加；与此同时，检验了来自江苏、河南、河北、辽宁、陕西、内蒙古等6个省或自治区的沙丁旺残体，采用了洗涤检验，真菌分离培养检验等方法，探讨了种子表面消毒，光照在真菌分离培养检验中的影响，并以解剖的方式研究观察了真菌在种子内部的侵染部位[35]。候天爵与刘爱萍等[36]在1998年对内蒙古锡林郭勒草原针茅属植物上进行了调查，发现有锈病，黑粉病等病害发生。1999年，候天爵、刘爱萍等[37]通过在室内和田间人工接种的方法观察和探讨了苜蓿锈病的寄主范围；鲁鸿佩、孙爱华、马绍慧等[38]定点和普遍调查的方法对临夏人工草地病害进行了调查，调查发现病害共32种，其中以锈病、霜霉病、白粉病、褐斑病为主要病害，并探讨了这类病害的综合防治方法。王生荣（2000年）[39]报道了甘肃省草本植物上发生的画眉草黑粉病(Ustilagospermophora)、白羊草黑粉病(sporisoriumandropogonis)、革玉梅黑橱病(Urocystisanemones)和蓼黑粉病(Microbotryumbistortarura)，并对其症状及病原菌进行了研究。王志明与岳民勤（2000年）[40]对岷县草地牧草病害、有毒植物危害情况进行了调查。周玉峰、唐成斌、韩永芬等（2001年）[41]对贵州南部地区禾草云斑病发生危害及防治进行了研究。周玉峰（2005年）[42]调查了贵州省牧草病害并探讨了相关防治方法，报道了黑麦草(LoliumDeren)冠锈病(PuccniacDronata)、褐斑病(Bipolarissorrkiniana)、大斑病、网斑病(Drechsleradictyoides)、禾草云斑病(RhyncDhsporiumsecalis)；三叶草(Trifoliumspp．)白粉病(Oidiumsp．，Oidiopsissp．)白绢根腐病(Sckrotiumrolfsii)、褐病(Uromycesstriatus)、白绢病(Sclerotiumrolfsii)。王生荣，陈诚等（2001年－2003年）[43]对草本植物白粉病进行了调查，报道了发生在草本植物上白粉菌上12个种，其中有8种是在甘肃省第一次正式记载，并对其病原形态、症状危害进行了描述记载。万豪、张小红等[44]在2008年对礼县草地牧草病害及有毒植物危害情况进行了调查。虽然我国没有专业的牧草病害研究机构，但上述专家学者对我国牧草病害的研究调查工作进行了较为系统的研究，尤其贵州，内蒙，甘肃，宁夏等草地上牧草病害的调查研究，但四川地区作为农业大省，畜牧业经济高度发达，人工牧草及天然草地面积较大，且四川气候特点导致该区病害发生较重，四川省对牧草真菌害的调查还没有系统的报道及研究。5植物病害对植物的影响植物病害是由植物病原物引起，植物病原物通常产生两种毒素，寄生选择性毒素和非寄生选择性毒素，寄主专化性毒素的作用机理非常专一，往对感病寄主植物才会产生毒害，它的作用靶位点专一，严重影响寄主植物代谢过程和能量改变过程，毒素主要通过对细胞壁、细胞膜、内质网、核糖体、细胞核及液泡等影响植物的正常生理生化活动，引起病变严重的将表现在形态上的创伤，甚至死亡。因此，研究探讨植物病原物与寄主植物的互作，引起互作中寄主植物的生理和化指标，有利于阐明寄主植物的抗病机理及病原物的植病机理，有利于探讨在抗病机中起抗病作用的结构和物质，为利用这些结构和物质为植物增加抗病性，并能进行相应的化学调控及抗病育种。病原物侵染对植物生理功能的影响主要表现在这几个方面：1.病原物侵染影响植物呼吸作用。一方面因为病原物产生的毒素氧化磷酸化过程与ATP合成解偶联，从而使植物正常呼吸作用不能产生所需的能量，而必须通过其他效率较低的途径产生能量。另一方面病原物的侵染加速了细胞原生质流动，促进了有机物合成、运输、积累，从而刺激了植物生长，所以需要更多的能量提供。2.病原物侵染影响植物的光合作用。病原物的侵染植物的绿色组织，造成光合作用的面积减少，从而减弱了光合作用效率；感病植物因其叶绿素遭到破坏，或者叶绿素合成受到抑制，从而降低了光合作用效率；叶绿体及其他细胞器结构破坏导致CO2固定率降低从而影响了光合作用效率；病原物侵染造成叶片气孔关闭和堵塞，以及叶肉胞之间CO2扩散的影响，导致光合作用下降；对光合作物产生的转化和转移的影响，因为合作物的产生被应用于病原物的代谢生长，从而减少了寄主植物所需要的能量。3.病原物侵染影响无机养分和水的代谢。感病植物感病后，病原物影响了植物体根吸收能力，抑制了根毛的形成；另外病原物产生的毒素会增加细胞膜的渗透性，造成细胞膨压失水，水分代谢失调。病原物真菌的菌丝、孢子及细菌菌体会分泌和产生的大分子物质及寄主植物本身由于被病原物侵染造成大分子化合物在导管中释放堵塞了导管。4.病原物侵染影响蛋白质代谢。病原物侵染初期，植物体的总N含量往往增加，可能是病原物侵染寄主后，寄主植物自生产生了诱导抗性的蛋白（渗透蛋白、核糖体失活蛋白）以及蛋白质类激素增加的缘故。然而一般在病害衰退期，蛋白质含量降低，游离氨基酸增加，其原因可能是蛋白蛋水解酶的增加从而搞高了蛋白质的降解。5.病原物侵染影响寄主植物活性酶。超氧化物歧化酶（SOD）活性变化，植物体在充他吸收利用氧的同时也产生了活性自由基，而植物体自身也形成了一套清楚活性氧自由基的系统，如抗坏血酸、维生素E、类胡萝卜素，更多的则是通过一套酶系统，SOD是酶促反应中的主要成员之一，它能起到清除自由氧保护植物细胞的作用。病原物在侵染植物体后往往会使细胞的SOD活性发生变化，SOD活性变化动态反映了植物抗病与反病的过程。过氧化物酶活性变化（POD），它是植物体内一种氧化酶，它催化脂肪酸合成、芳香胺及酚类物质，同时参与氧自由基的清除反应，虽然还不太清楚POD在植物抗病性中所起的生化机制，但多数研究认为POD活性与植物体抗病性相关，植物抗病品种在遭到病原物侵染后POD活性上升，而感病品种，POD活性基本上保持不变，或者会延心一段时间再升高，而抗性的程度不同，植物体POD活性增福不同，抗性越高的植株及POD活性增幅越大。过氧化氢酶（CAT）活性变化，也是植物体内活性氧清除剂，目前也已证明CAT活性与植物的抗逆、抗病相关，但对植物病害反应的作用机理尚不清楚。第2章四川地区牧草病害调查鉴定1材料与方法1.1调查时间和地点调查从2009年开始到2011年结束，共两年多点多次重复调查，地区分别选自四川省的雅安、绵阳、广元、达州、阿坝、凉山和德阳总共7个地区，该7个地区牧草种植品种及气候都有较为显著的差异，并在每个地区随机选择了3个县或者村的牧草基地进行了试验:调查病害，采集病株。1.2调查方法和鉴定方法1.2.1调查方法在牧草生长较好的季节，并在这些时间里选择病害发生高峰时期进行调查，并采集病害标本，主要采用普遍调查的基础上定点观察的方法。并在每一块样地采用五点取样的方法进行调查和采样。一些常见病害由西南科技大学康教授及四川省草原总站保护科周老师直接鉴定确认，对于较难辨别病害通过真菌分离，光学显微镜及电子显微镜镜检，根据病原菌形态确认病害及病原物类型。1.2.2植物病原菌的分离方法本实验采用的常规分离方法及单孢分离相结合的方法对采集到的病害鲜标本直接进行挑取孢子制作载玻片进行镜检或通过保湿培养、病原菌分离培养的方法培养后挑取孢子或菌丝体等病原物进行镜检。由于各种病原菌发生的部位不同，根据不同的部位采用如下的一些分离方法。斑点及叶斑类型病害病原的分离将带病斑点的叶片或植株体组织分离的方法，一般是在病健交界处剪取0.5-1cm左右的正方体小块，用蒸馏水冲洗后放入到70%的酒精溶液中侵泡30s，然后放到2.5%的次氯酸钠溶液中侵3-5min，取出用无菌水反复冲洗3次后，移置到PDA培养基，培养皿倒置，将培养皿置于25℃恒温箱中培养。维管束内部的病原菌的分离有些病原菌侵入到植株体的根、茎内的维管束中，这种分离方法是首先将带病斑的植株体的表面消毒后，用灭过菌的解剖刀将病株的表皮组织切去，露出维管束组织，然后取出里面变色的小块维管束组织，并将小块的维管束组织移置到PDA培养基上与前一种分离方法相同的进行组织体培养，病株体表面消毒按照1的方法用70%的酒精，2.5%次氯酸钠溶液侵泡，将酒精侵泡过后的病株体用火烧进行消毒，这种方法在烧的过程中要不影响到植物组织体内的病原。根腐病类的病原病的分离方法这种类型的病原菌分离方法一般是根据材料的大小决定，材料大的可以用维管束内部病原菌分离方法进行分离，材料小的可以用斑点类型组织分离的方法进行分离。实验室排除细菌霉等污染的方法真菌的分离鉴定很容易污染上细菌，这就造成病原菌分离不纯，为病原菌的鉴定带来麻烦，实验室一般采用在高压灭菌后，每300ml左右培养基中加入20滴乳酸来抑制细菌的污染。1.2.3供试验用的培养基根据各种病原菌所需营养物质及条件配置不同的培养基，该实验用到如下一些培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)PotatoDextroseAgar配方:200g马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，自来水1000ml，将土豆切成小块加水煮烂，一般煮沸20至30分钟，用纱布过滤到残渣，依次加入葡萄糖琼脂，定容至1000ml，分装锥形瓶。PSA培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)PotatoSucroseAgar配方：200g马铃薯，15-20g琼脂粉，20g蔗糖，操作方法与PDA配制相同。PCA培养基(马铃薯胡萝卜培养基)PotatoCarrotAgar配方：是将PDA培养基中的20g葡萄糖由15g胡萝卜取代，方法是与PDA培养基制作相似。WA培养基(琼脂清水培养基)WaterAgar配方：琼脂15至20g自来水1000ml，将水煮沸，把琼脂全部溶化大水里并定容到1000ml即可。CWA培养基(玉米粉琼脂培养基)CornmealWaterAgar配方：玉米粉300g琼脂15至20g自来水1000ml。配制方法如PDA，将清水煮沸依次加玉米粉，琼脂，并定容至1000ml。OA培养基(燕麦片琼胶培养基)，OatmealAgar配方：燕麦片30g琼脂粉15g至20g加水1000ml，配制方法与PDA相同，并分装锥形瓶灭菌。1.2.4鉴定方法 (1)观察病害发生部位的症状，结合各种病害的相关文献以及较为系统权威的病害相关的书籍，通过对各种病害症状描述，发生的时期及气候条件来确定引起发病的病原菌，此法主要针对一些比较常见并且易于观察的病害。(2)在病害症状观察的基础上，采用病原物显微观察，具体方法是:①病原菌载玻片制备：对于病症比较明显病株(对于病症不明显的病株，应当采用分离培养的方法或者保湿培养的方法，是病株发病部分产生较为明显的病原物)，用接种针或者挑针挑取病部组织上的病原物制成载玻片。②显微镜观察：观察倍数在400倍，观察病原在显微镜上的孢子、菌丝等形态，及大小，通过在真菌鉴定手册或者真菌分类学等相关书籍上查阅比对确定引起病害的病原菌类型[4-5]。(3)利用柯赫氏法则:将分离得到的病原菌接种到健康植株上，看是否产生相同症状，确认并验证待检测病害及病原物类型。2调查结果2.1调查的牧草种类通过向相关人员了解，调查的品种主要是紫花苜蓿。2.2调查结果在四川地区中，牧草上均有锈病的发生。紫花苜蓿上以锈病、褐斑、霜霉、菌核、白粉病居多，且在各个地区均见有发生，但以达州、凉山、绵阳发病较重，其他地区次之。四川各地紫花苜蓿病害及病原物类型归纳如下：2.2.1紫花苜蓿真菌病害⑴锈病病原：为担子菌亚门单胞锈菌属条纹单胞锈菌(Uromycesstriatus)。症状：侵染叶片、叶柄、茎及荚果。叶片病斑主要发生于叶片下部，病斑较少，近圆形疱状，初呈灰绿色，后表皮破裂呈粉状；茎上孢子堆较大，近圆形或椭圆形并隆起。⑵白绢病病原：为半知菌亚门小菌核菌属齐整小菌核菌(Sclerotiumrolfsii)。症状：该病主要从苜蓿分枝到现蕾期发生，主要侵染苜蓿的根茎部或茎杆的基部，在发病初期逞水渍状病斑，其后继续扩展直到内部组织，造成根部产生褐色的坏死斑块.病菌侵染后，在白天逞现出萎蔫症状，在夜间或者清晨时植株又恢复正常，这种现象在晴朗天气尤为明显，持续几天后植株死亡，此时有部分植株叶片呈现红褐色。发病后期茎基部纵裂，同时病部表面长出白色绢状菌丝层。⑶褐斑病病原：子囊菌亚门、假盘菌属的苜蓿假盘菌(Pseudopezizamedicaginis)，异名是三叶草假盘菌。症状：病斑为不规则的圆斑，红褐色，斑上有黑点，有时密集成环，严重时病叶枯死、脱落。病原菌的子座和子囊盘多生于叶上面的病斑中。茎上病斑长形，黑褐色，边缘整齐。病斑多半先发生于下部叶片和茎上，感病叶片很快变黄，脱落。褐斑病主要危害苜蓿等豆科植物的叶片、茎、荚和种子。⑷霜霉病病原：苜蓿霜霉菌(personsporaaestivalisSyd)，异名是三叶草霜霉菌。症状：感病植株的叶片出现局部不规则的退绿斑。病斑无明显边缘，病斑逐渐扩大，最后可使整个叶面布满病斑。发病严重时，可造成叶片卷缩到一起，植株节间缩短，严重的可造成病叶坏死腐烂，尤其是在嫩枝、嫩叶上症状表现明显，有扭曲崎形的，有短变粗的，并且会使整株矮化褪绿，这就使得不能形成花序，茎杆和叶片枯死。在幼嫩部分褪色的病斑上面和叶片背面有灰白色霉层出现，后逞现淡紫色霉层。⑸白粉病病原：白粉菌:豆科内丝白粉菌(LeveillulaleguminosarumGolov)、豌豆白粉菌(ErysphepistDC）。症状：植株的叶片、叶柄、茎、荚果等均可受到侵染，出现白色粉霉斑。在叶片上，背面霉斑明显多于正面。病斑初为原形、絮状，然后病斑扩大汇合，几乎占据全部叶面，絮状斑变为较厚的，毡状白色霉层。⑹菌核病病原：三叶草核盘菌(ScjerotiniatrifoJiorum)，异名：杯状核盘菌。症状：侵害的主要部位是根茎和根系，造成根茎与根系变成褐色，水渍状并腐烂死亡。发病部位在春季会产生白色絮状菌丝体，随后产生小瘤状黑色的菌核。该病常常造成牧草缺垄断垄或者成片死亡，草地牧草生长不良。⑺黄斑病病原：苜蓿黄斑病菌(Leptotrochilamedicaginis（Fckl.）H.Schiiepp)，异名：苜蓿埋核盘菌。症状：病斑主要发生在叶片上，叶柄和茎上也有发生。感病的叶片最初为褪绿的小病斑，随后扩大为褪绿条斑，继而变成淡黄色或橙色大病斑，病斑扩展常受叶脉限制，呈扇形或沿叶脉呈条状，有时也稍呈圆形。病斑上可见许多小黑点，即病原菌无性时期的分生孢子器腔。夏末以后，病组织上出现许多肉眼可见的小杯状物，橙黄色至黑色，即病原菌的子囊盘，多发生在死亡的叶片背面。春季地面的枯叶上也可形成小点状子囊盘。⑻春季黑茎病和叶斑病病原：苜蓿茎点霉(Phomamedicaginis)，异名：苜蓿草茎点霉症状：叶、茎、荚果以及根颈和根上部均可受到侵染。早期在下部叶片、叶柄和茎上出现许多小的、暗褐色至黑色、近圆形或不规则形的病斑。小病斑常呈黑痣状。随病斑增大，常常相互汇合，叶片变黄，枯萎脱落。当病斑发生于叶绿或叶尖时，常呈近圆形、椭圆形、不规则形或楔形的大斑，颜色自淡黄褐色、褐色至黑色不等，可略成轮纹状，病斑之外有时具淡黄色晕圈。病斑死组织上可见不太明显的小点，即病原的分生孢子器。因叶部病斑具轮纹，又称叶斑为轮纹病。⑼尾孢叶斑病（夏季黑茎病）病原：苜蓿尾孢(CercosporamedicaginisEll.etEv.)症状：叶片上先出现小的褐色斑点，以后扩大成具有不规则边缘的大斑，直径2-6mm，外围常呈黄色。孢子产生时病斑变成银灰褐色。叶部的病斑出现在茎部症状之前。一片小叶可出现2-3个病斑，并在几天内脱落。由下部叶片逐渐向上脱落，是本病最明显的症状。茎部感染出现红褐色至巧克力色的长形病斑，病斑扩大并互相汇合直到大部分茎变色。侵染的菌丝不穿透厚壁组织的维管束鞘，病斑被限制在皮层。⑽炭疽病病原：引起苜蓿炭疽病的常见有三种刺盘保：三叶草刺盘孢(Colletotrichumtrifolii)；毁灭刺盘孢(Colletotrichumdestructivum)；平头刺盘孢(Colletotrichumtruncatum)。症状：病斑出现于植株的各部位，但以茎杆上常见。在抗病植株的茎上，有少数小的、不规则的黑色斑，在感病植株的茎上，出现大的卵圆形至菱形病斑，大病斑稻草黄色，具有褐色边缘。病斑变成灰白色，其上出现褐色小点，即病菌的分生孢子盘，用手持扩大镜很容易看到。当病斑扩大时，相互汇合，环茎一周。同一病株内常有1至几个枝条受害枯死。⑾腐霉根腐病病原：腐霉菌:终极腐霉(PythiumultimumTrow.)、畸雌腐霉（P.irregulareBuisman）、华丽腐霉(P.splendensH.Braun)。症状：当侵染发生在发芽阶段的后期，病斑更典型地局限于下胚轴和根上，使之变成水渍状，最终衰弱凋萎，幼苗倒下或矮缩，子叶小，呈暗绿色，几天之内变死掉，也即出苗前后的猝倒病。在潮湿的天气，适宜温度和充足的土壤水分条件，幼苗主根感病后，还可有病部以上生出的二次根生存。幼苗胚根受到腐霉菌侵染，形成叉状根，即几条不定根同时深入土中。⑿丝核菌根腐病病原：立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)异名：丝核薄膜革菌。症状：丝核菌在苜蓿幼苗阶段引起猝倒症，还引起成株期的根溃疡、芽腐、根颈腐烂、茎基腐以及茎和叶的枯萎等症状。根部被侵染后，形成椭圆形，凹陷的溃疡斑，黄褐色至褐色，病斑边缘的颜色较深。叶和茎受到侵染后，出现灰色并带暗红色和褐色边缘的病斑，形状不规则，病组织很快呈现水渍状崩解，数日内蔓延到许多植株上。⒀花叶病病原：苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus，AIMV)。症状：花叶症状主要在春、秋季节较冷凉条件下，表现于感病型的苜蓿上。夏季叶上症状不明显。叶部症状有淡绿或黄化的班驳，叶或叶柄扭曲变形，枝茎矮化。⒁菟丝子害病原:苜蓿菟丝子(CuscutaapproximataBab)。症状：菟丝子的茎缠绕于寄主植株的地上部分，从一单株向四周蔓延，被害草地面积的直径可达9m以上最初仅寄主植物上缠有黄色的丝状物，菟丝子开花后可见黄白色至粉色的头状花序附在寄主的茎上，形成寄主与菟丝子混合的黄色。第3章结论与讨论1四川地区紫花苜蓿病害的调查通过长时间的研究与调查，发现了紫花苜蓿草上14种常见病害。针对其中比较严重的病害总结出了以下几种防治措施：（1）锈病：发病期可用代森锰锌(0.2kg/hm2)、氧化萎锈灵与百菌清混合剂(0.4－0.8kg/hm2)、15%粉锈宁1000倍液喷雾；（2）霜霉病：发病初期可喷200倍的波尔多液、65%代森锰锌400-600倍液或50福美双500-800倍液；（3）白粉病：在病害发生季节提前喷洒40%灭菌丹可湿剂600-800倍液或15%粉锈宁1000倍液做好预防，在病害发生时用世高500-1000倍液进行防治；（4）褐斑病：在发病季节到前喷洒70%代森锰锌600倍液、75%百菌清500-600倍液或5%多菌灵可湿剂500-1000倍液进行防护。发病后，可以喷洒世高500-1000倍液进行防治，若病害发病严重，应提早刈割，以减少病害的传播。同时，通过查阅相关文献，系统的归纳整理病害类型和规律，提出了一套综合防治策略:(1)选择草种要合理。加强种子的检疫，使用无病种子。各地生长情况气候特点不一样应当选择适应当地且具有抗病耐病抗逆的品种，应当在培育优良牧草引中驯化的过程中不仅仅考虑产量还应当考虑到牧草品种抗病组分[10，11]。（2）在栽培管理的过程中，应当适合降低种植密度使草地通风透光性更好，适量降低适度保证湿度不能偏高同时也要避害免过旱。肥料使用时应当适当减少N肥使用增施P、K肥。（3）加强化学防治。目前化学防治是防病杀菌的一个重要方法，但因为过度使用化学物质，造成环境污染，以及农药等危害人体健康的物质残留，过度使用专一性高毒性的杀菌剂造成了病菌产生较强抗性，这些都应当引起我们的高度重视。所以化学防治应当以高效性，低毒性，低残留性，广谱预防保护性杀菌剂为主，尽量在发病初期进行喷药预防以防扩大侵染。（4）避免连作。最好选择未种过紫花苜蓿或种植过紫花苜蓿但轮作过的地块，这样可以有效的防治发生紫花苜蓿病害。（5）加强田间管理。及时铲除病株，防止健康植株受到感染。发生大面积病害时，应及早刈割。本次调查所选的地区牧草种植面积较大，且属于不同的气候，较能全面反映四川牧草栽培状况。调查结果与国内其他地区牧草病害发生及病原菌类型基本上是吻合的[5]，但调查仅对四川主要病害进行了报道和病原菌确定，未能对各种病原菌做系统的研究，以及对牧草抗病性品种筛选有待下一步进行。我国草种资源丰富，应当充分开发和挖掘本国、本地区抗病种质资源。研究牧草真菌病害的致病机制，加强对我国的牧草抗病品种选育，选育出适合我国生态环境的优质、抗病草种或品种是当今牧草育种的一个重要课题。综合防治是牧草病害防治的趋势，应加强对牧草病害综合防治技术的研究[12]。参考文献[1]林超文，陈一兵，张庆玉等.四川盆地丘陵区牧草种植前景展望[J].安微农学通报，2006，12(12)：77-78[2]杨玉凤.牧草常见病害及防治措施[J].北京农业，2003(6):24-28[3]张新全，张锦华，杨春华.四川省牧草种质资源现状及育种利用[J].四川草原，2002（1）:6-9[4]方中达.植病研究法(第三版)[M].北京:中国农业出版社，1998[5]徐秉良.草坪技术手册:草坪保护[M].北京:化学工业出版社，2006[6]南志标，李春杰.中国牧草真菌病害名录[J].草业科学(增刊)，1994，151-200[7]王志明，岳民勤.岷县草地牧草病害、有毒植物危害情况的调查[J].草原与草坪，2000(3):41-43[8]鲁鸿佩，孙爱华，马绍慧.临夏州人工草地牧草病害调查及苜蓿霜霉病防治[J].草业科学，1999，16(6):43-49[9]赵美琦，肖悦岩，陈合明.南亚热带湿润草地病害的基本调查[J].中国草地，1999，46-49[10]马建萍，李积海1浅谈种草养畜在农业经济中的作用[J].青海农牧业，2005,82(2):4-8[11]武新，马占鸿.宁夏牧草病害调查与防治研究工作报告[J].宁夏农学院学报，1994，15(3):72-75[12]牛永春.真菌系统分类与鉴定中的新方法[J].北京林业大学学报，1995，17(2):94-98[13]张宏.真菌分类学中的分子生物学技术点评[J].国外医学皮肤性病学分册，1997，22(4):215-219[14]HAWKSWORTHDL，KIRKPM，SUTTONBC.Ainsworth&Bisby’sDictionaryofthefungi[M].8th.UK:CABInternational，1995[15]HAZENKC.Methodsforfungalidentificationintheclinicalmycologylaborator[J].ClinMicrobiolNewsl，1996，18:137-144[16]刘若.早熟禾白粉病的初步研究[J].甘肃农业大学学报，1974，(1)：69-71[17]刘若.苜蓿霜霉病的调查研究[J].甘肃农业大学学报，1976，(3)：39-40[18]刘若.天祝金强紫花苜蓿(Trig