昆虫病原细菌的利用

关于昆虫病原细菌的利用第一页，共六十五页，2022年，8月28日

自然界中，细菌种类繁多，数量大，分布广泛，其中能使昆虫感染致病的虫生细菌相当多，昆虫因细菌而引起的疾病称为细菌病。细菌病有多种，但细菌病有其共同的特征，即当昆虫感病后，不大活动，食欲减退，口腔及肛门常有排泄物，病原菌侵入体腔后引起败血症。死后虫体色加深，一般都有一股臭味。由于体都软化腐烂，所以通称为软化病。第二页，共六十五页，2022年，8月28日一、昆虫病原细菌的主要类群

Bucher（1960）分为专性病原细菌、产生晶体的芽孢杆菌、兼性病原细菌和潜势病原细菌。通常分为3类：专性兼性潜势病原细菌

第三页，共六十五页，2022年，8月28日（一）专性昆虫病原细菌（Obligateentomopathogenicbacteria）

只能在寄主细胞中生长繁殖，不能在人工培养基上正常生长，一般经口服传染。自然界中寄主范围较窄。日本金龟子芽孢杆菌（Bacilluspopilliae）天幕毛虫芽孢杆菌（Clostridiummalacosomae）第四页，共六十五页，2022年，8月28日Bacilluspopilliae第五页，共六十五页，2022年，8月28日（二）兼性病原细菌（Facultativeentomopathogenicbacteria）

可在昆虫体以外的生境中增殖，也能在人工培养基上正常生长发育的细菌。包括产孢和不产孢的杆菌。寄主范围较广。苏云金杆菌Bt粘质沙雷氏菌等

第六页，共六十五页，2022年，8月28日（三）潜势病原菌（Potentialentomopathogenicbacteria）

普遍存在于昆虫的消化道中，主要是一些不产生芽孢的杆菌。由于毒素和酶的产生数量少，难以侵入体腔内给宿主造成危害。

第七页，共六十五页，2022年，8月28日（四）细菌杀虫剂的特点●（1）毒力高。菌剂毒力足以压倒害虫的抗病力，能够稳定可靠地使害虫发病致死；●（2）稳定性。菌剂不致因受自然环境影响（如日光、干燥等）、人工处理、悬浮剂、载体、贮藏、不同施药方式等而减低杀虫效力；第八页，共六十五页，2022年，8月28日●（3）残效期长，并有在害虫种群中自然传播的能力；●（4）作用迅速；●（5）有选择性。即对防治对象剧毒，而对植物、益虫以及哺乳动物等无毒；●（6）可以大规模生产，经济安全。第九页，共六十五页，2022年，8月28日二、金龟子乳状病芽孢杆菌

Dutky（1940）报道日本金龟子芽孢杆菌（B.popilliae）能引起日本金龟子等幼虫的乳状病（Milkydisease）。其后世界各国从不同金龟子幼虫分离出乳状病原细菌多种。

用金龟子芽孢杆菌防治日本金龟子是生物防治最典型的例子之一。第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂于1950年在美国登记，成为美国政府批准的第一个生物防治制剂。第十页，共六十五页，2022年，8月28日Grubinfectedwithmilkydisease(left)causedbyabacteriumcallBacilluspopilliae第十一页，共六十五页，2022年，8月28日第十二页，共六十五页，2022年，8月28日1、侵染过程金龟子芽孢杆菌主要通过芽孢感染和传播，芽孢经口摄入。当幼虫吞食芽孢后，芽孢在肠道中萌发成杆状的营养细胞，营养细胞侵染中肠细胞，随后穿过肠壁进入体腔，大量繁殖，形成芽孢，使幼虫的血淋巴呈乳状，死亡幼虫呈乳白色，故称为乳状病（Milkydisease）。第十三页，共六十五页，2022年，8月28日2、致病机制尚不清楚，主要有两种观点

●由于细菌在生长过程中利用了昆虫的大量营养物质和多种生长素，致使昆虫不能正常发育。●破坏了昆虫的某种酶系统，从而抑制了寄主昆虫的生活机能。第十四页，共六十五页，2022年，8月28日3、培养繁殖

金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活，营养体也能在人工培养基上生长繁殖，但却不能在人工培养基上正常地形成芽孢。因此，商品制剂Doom、Japidemic和MilkySpore都是采用幼虫活体培养的方法制备的。

3龄幼虫

饲育缸微量注射，3ml/头100万芽孢/ml研碎，稀释，晾干、包装

1-3周1亿芽孢/g菌剂第十五页，共六十五页，2022年，8月28日4、应用研究由于芽孢在土壤中能长期存活，感病死亡后的蛴螬又会不断增加土壤中的芽孢数量，因此疾病一旦形成，芽孢便能在土壤中逐渐累积和传播，从而达到长期控制的效果。利用金龟子芽孢杆菌防治蛴螬是一种有效的生物防治法。美国在13个州和哥伦比亚地区利用金龟子芽孢杆菌防治蛴螬面积达10余万英亩，防治效果为60—80％。第十六页，共六十五页，2022年，8月28日5、注意事项土壤中含菌量与乳状病感病率成正相关。如每千克土壤含芽孢4×109个，乳状病发病率为82％,每千克土壤含0.25×109个芽孢时，则发病率仅为44％。温度条件。乳状病发病适温为28-30℃，如温度低于16℃，几乎不发病。第十七页，共六十五页，2022年，8月28日三、球性芽孢杆菌

球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)在自然界分布广泛，大多数菌株对昆虫没有毒性，但有一些对蚊幼虫有高毒力，它的毒效成分在细胞内，不分泌到细胞外的培养液中。因此，只有昆虫吞食细胞后才显示毒性。第十八页，共六十五页，2022年，8月28日1、球形芽孢杆菌的毒素（1）二元毒素（BinaryToxin,Btx）分子量为42kDa和51kDa的蛋白质，只有当两种蛋白质在一起时才产生毒性，两种蛋白等量时达到最大杀蚊毒效。它的伴孢晶体被部分地包在芽孢外壁之中，使得芽孢和伴孢晶体在离体的条件下仍是一个整体。目前已对多个菌株的二元毒蛋白基因进行了测序。第十九页，共六十五页，2022年，8月28日（2）蛋白毒素（Mtx）在营养生长期产生的蛋白质，同芽孢的合成无关。Mtx毒素不稳定，热处理、反复冻熔都会严重影响其杀蚊活性。这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析。第二十页，共六十五页，2022年，8月28日2、球形芽孢杆菌的杀虫范围球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫，它通过取食过程进行感染，蚊子的幼虫在取食8-12h后，即可发生死亡，幼虫吞入球状芽孢杆菌后，菌体在肠道中被消化，细胞壁破裂，菌体内的毒素释放出来，从而杀死蚊虫的幼虫。第二十一页，共六十五页，2022年，8月28日3、球形芽孢杆菌的利用

球形芽孢杆菌在昆虫死后，可以在虫尸中重新增殖，芽孢的数目增加。球形芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体在环境中持效期较长，并有可能在环境中再循环。因此，从20世纪80年代中后期开始，球形芽孢杆菌高毒菌株的筛选工作开始受到重视。迄今为止，美国、法国及我国等10个国家研制了不同剂型的产品10余种，主要用于杀蚊幼虫的效果评价。第二十二页，共六十五页，2022年，8月28日目前使用最多的球形芽孢杆菌制剂主要是乳剂和粉剂。第二十三页，共六十五页，2022年，8月28日四、苏云金杆菌

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）最早发现于1902年，1938年世界上第一个Bt制剂Sporeine在法国问世，从而掀开了苏云金芽孢杆菌杀虫剂生产的序幕。近10年来，Bt已成为加拿大控制枞色卷蛾（Sprucebudworm）的主要手段。在其它国家，Bt运用于控制毛虫、吉卜赛毒蛾（gypsymoths）等。目前全世界约有Bt杀虫剂100多个品种，年销售额近1亿美元。第二十四页，共六十五页，2022年，8月28日ThisleafrollercaterpillardiedafteringestingBacillusthuringiensis.Discolourationofthegut,asseenhere,istypicalofmortalityfromBacillusthuringiensis第二十五页，共六十五页，2022年，8月28日（一）基本特征1、形态特征（1）营养期

G+的好气性芽孢杆菌，两端钝圆，周生鞭毛，能运动，少数无鞭毛，营养体单个存在或2-5个成链状。内生芽孢椭圆形或圆形。第二十六页，共六十五页，2022年，8月28日营养体为繁殖阶段，横裂生殖，对数生殖期往往2、4、8个或更多的营养体连在一起成串状。此时繁殖快、代谢旺盛，适于用作接种材料。营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。第二十七页，共六十五页，2022年，8月28日（2）孢子囊期

当菌体成长老熟时，其一端斜生一个椭圆形的芽孢，另一端同时出现菱形(或其他形状)的晶体即伴孢晶体(Parasporalcrystal)，是其主要的活性成分，伴孢晶体由不同分子量的多肽—原毒素（protoxin）组成，此时为孢子囊期。孢子囊呈长卵圆形，比营养体粗壮。用石炭酸复红染色时，营养体为红色，晶体深红色，而芽孢不着色仅见具有轮廓的折光体。第二十八页，共六十五页，2022年，8月28日Bacillusthuringiensissporeandproteincrystals第二十九页，共六十五页，2022年，8月28日（3）芽孢和伴孢晶体的释放孢子囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢和杀虫晶体蛋白。

芽孢是细菌的休眠体，对高温、干燥等不良环境条件有较强的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期贮存。芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体。

伴孢晶体内含蛋白质毒素，是杀虫的主要有效物质。

第三十页，共六十五页，2022年，8月28日2、培养特征苏云金杆菌能在多种培养基上生长，在不同的培养基上形成的茵落形态有所不同。苏云金杆菌的不同变种在相同的固体培养基上，培养性状基本上颇为近似，但也表现有一定程度的差异。第三十一页，共六十五页，2022年，8月28日3、生理特性Bt.对营养条件要求不高。

碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖等。氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉，玉米浆等。无机盐：磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙等。Bt.在12-40℃间的温度条件下都能生长，以27-32℃较为适宜，35-40℃生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。该菌适于微碱性条件，最适pH是7.5，当pH达8.5时还能正常形成芽孢，如pH降至5以下则不能形成芽孢。

第三十二页，共六十五页，2022年，8月28日4、苏云金芽孢杆菌的类群

根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性，苏云金芽孢杆菌可划分为71个血清型和88个血清型亚种。到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的有害生物有活性。少数苏云金杆菌产生外毒素（exotoxin）血清，对家蝇亦有毒性。第三十三页，共六十五页，2022年，8月28日5、苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的致病性和毒力的差异

苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大。即使是同一个亚种，不同菌株对昆虫的毒力差异也可以很大。毒力的大小与产生的毒素有关，也与细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关。第三十四页，共六十五页，2022年，8月28日（二）苏云金杆菌的毒素和致病机理1、苏云金杆菌的毒素苏云金杆菌能产生对多种昆虫或其他无脊椎动物有害的活性成分，这些活性成分是其杀虫的核心。目前，已从Bt中发现了10几种有不同功能的生物活性成分。第三十五页，共六十五页，2022年，8月28日（1）杀虫晶体蛋白（Insecticidalcrystalprotein，ICP）

伴孢晶体（Parasporalcrystal）、伴孢晶体包含体（Parasporalcrystalinclusionbody）、晶体蛋白（Crystalprotein）、晶体毒素（Crystaltoxin），又称δ-内毒素，是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素。

ICP由cry基因和cyt基因编码，这些基因大多位于染色体外的质粒上。ICP的分子量27-140kDa,形状各异。Bt的杀虫活性与ICP的形状、结构、大小密切相关。第三十六页，共六十五页，2022年，8月28日①ICP基因的命名1981年Schnepf从HD-1中克隆到了第1个ICP基因。1998年Crickmore依据ICP基因的核苷酸序列及其演化关系，将ICP基因分为4级。2009年8月，ICP基因按照核苷酸序列的同源性已被分为cry1-cry59,cyt1和cyt2共61类，487个，其中cry基因460个，cyt基因27个。第三十七页，共六十五页，2022年，8月28日②ICP的三维结构及功能ICP中最先获得三维结构的是鞘翅目昆虫特异性毒素蛋白Cry3A，接着又获得鳞翅目昆虫特异性毒素蛋白Cry1Aa的三维结构。结构域Ⅰ：由8个α螺旋组成，与细胞膜插入及孔隙形成有关；结构域Ⅱ：由3个β折叠片和2个短的α螺旋组成，与昆虫上皮细胞表面毒素受体的结合有关；结构域Ⅲ：由2个β折叠片形成一个面对面的β夹层结构，具有毒素的稳定性、特异性与结合有关。第三十八页，共六十五页，2022年，8月28日（2）营养期杀虫蛋白（Vegetativeinsecticidalprotein，VIP）是专指营养期表达的杀虫蛋白。具有热不稳定性的可溶蛋白，95℃处理20min便失去活性。2009年8月，有65个vip基因被鉴定分离。VIP由vip1、vip2、vip3三种基因编码，杀虫活性各不相同，且在氨基酸序列的进化上与ICP没有任何同源性。第三十九页，共六十五页，2022年，8月28日Vip3A以可溶性蛋白的形式存在于害虫中肠，与中肠上皮细胞上的受体结合，形成稳定的离子通道，破坏中肠形成孔洞，造成昆虫死亡。对夜蛾科害虫具有广谱的杀虫活性。一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫对Vip3A都较为敏感，如Vip3A对小地老虎的毒性要比Cry1Ac高260多倍。第四十页，共六十五页，2022年，8月28日（3）β-外毒素（苏云金素thuringiensin）

是Bt在生产阶段产生的一种热稳定（121℃处理15min，杀虫毒力不降低）、低分子量（701kDa）腺嘌呤核苷酸衍生物，主要存在于Bt血清型H1菌株中。它是一种胞外因子，对蝇类毒力高，称为“蝇因子”或“蝇毒素”；对紫外线稳定。杀虫谱较杀虫晶体蛋白广，对线虫、螨类均有毒杀作用。主要通过抑制RNA聚合酶的活性阻断RNA合成导致昆虫死亡，因而对人类和动物有一定毒性。第四十一页，共六十五页，2022年，8月28日（4）双效菌素（zwittermiciaA）即ZwA因子，是在Bt和蜡质芽孢杆菌Bacilluscereus(Bc)中发现的一种线形氨基多元醇类化合物。可溶于水，碱性条件下易水解，对热敏感。可抑制子囊菌、担子菌的生长。虽然其杀虫活性低，但对Bt的其他杀虫活性物质具增效作用，特别是与许多ICP混用时，不但具高的增效作用，还可减缓害虫的抗性。双效菌素化学结构简单，可以人工合成，具有很好的开发利用前景。第四十二页，共六十五页，2022年，8月28日2、苏云金杆菌致病机理苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要是通过昆虫食入菌剂而引起的。菌剂包括芽孢和细菌所产生的毒素。菌体本身的繁殖可导致害虫的死亡，而昆虫能在短时间内死亡往往是苏云金杆菌产生的毒素所致。苏云金杆菌对多种昆虫能引起发病而致死，但对另一些昆虫则致病力很差，甚至没有作用。第四十三页，共六十五页，2022年，8月28日ICP的致病机理首先溶解在昆虫的中肠中，ICP被昆虫的中肠蛋白酶加工成有活性的毒素；随后被激活的ICP结合到中肠上皮细胞的刷状缘膜上的特异受体上；最后ICP与受体结合从而引起毒素构象变化，并使之能够融合到中肠膜上，使膜形成孔隙和离子通道，导致昆虫死亡。昆虫对ICP抗性的产生往往就是因为受体结构的改变。第四十四页，共六十五页，2022年，8月28日WhalonandWinge,2003第四十五页，共六十五页，2022年，8月28日（三）Bt内毒素的利用1、含Bt内毒素新菌株的利用

从20世纪80年代中后期开始，利用DNA重组技术对毒素基因进行改造，构建综合性能优良的重组菌株已成为国外各大生物农药公司的目标，目前已有10余种遗传重组杀虫剂被批准进行后期田间试验。通过构建重组菌株可以实现以下目标：●（1）扩大杀虫谱；●（2）延长杀虫毒素的持效期及改进释放性能；●（3）提高毒力和杀虫晶体蛋白的产量。第四十六页，共六十五页，2022年，8月28日2、含Bt内毒素的转基因作物的利用

1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中以双子叶植物居多，而单子叶植物由于其遗传转化较困难，所以获得的转Bt基因的植物就相对较少。在已获得的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物中，绝大多数植物对靶标昆虫产生了强烈的毒杀作用，有效地减少了害虫损失。第四十七页，共六十五页，2022年，8月28日第四十八页，共六十五页，2022年，8月28日第四十九页，共六十五页，2022年，8月28日2004年全球转基因玉米、大豆、棉花和其它作物播种面积达到了2亿英亩，比2003年的1.67亿英亩增长了20%。

第五十页，共六十五页，2022年，8月28日第五十一页，共六十五页，2022年，8月28日Unsprayed,non-transgeniccotton(left)andunsprayedBt(Cry1Ac)cotton(right)priortoharvest第五十二页，共六十五页，2022年，8月28日转基因作物的优点：●（1）己发现的高水平的Bt抗性基因都是隐性基因，在植物体内可稳定地遗传与表达；●（2）杀虫蛋白对昆虫的幼虫特别有效，可实现虫害的早期防治；●（3）可实现植物的整株保护，尤其是化学药剂喷施不到的部位的防治（如钻心虫）●（4）对人、畜及非靶标动物群休无害，不会破坏生态平衡。由于毒蛋白存留在植物组织中，不会污染环境；●（5）抗性持久，不易被环境因素所破坏。第五十三页，共六十五页，2022年，8月28日3、害虫对Bt的抗性

自20世纪90年代以来，在美国、泰国、马来西亚、日本、中国等先后发现小菜蛾田间种群对Bt产生抗性以来，至少已有10种蛾类、2种甲虫、4种蚊蝇类经50次以上反复Bt处理而表现有选择抗性。在16种虫种中经3~120代后增高10倍。

大多数对Cry毒素抗性产生的机理都和受体结合区域的突变有关。第五十四页，共六十五页，2022年，8月28日SomeinsectspeciesandnematodesresistanttoCrytoxinsBravoandSoberon,2008.第五十五页，共六十五页，2022年，8月28日延缓害虫产生抗性的方法：（1）在转基因作物中加入新的杀虫基因，如Bin-like-Cry、Mtx-like-Cry和Vip毒素等。（2）在转基因作物或工程菌中加入多种作用机理不同的cry基因，如将能够与不同受体结合的cry基因在一株植物中表达。这样，害虫世代间同时产生对多种毒素抗性的可能性就呈指数级下降了。第五十六页，共六十五页，2022年，8月28日（3）对Cry毒素进行分子改造，使其绕过与主要受体的作用，而直接产生活性。（4）利用钙粘蛋白碎片来抑制害虫的抗性。钙粘蛋白的CR12区域能够提高Cry1A对鳞翅目害虫的活性。第五十七页，共六十五页，2022年，8月28日五、苏云金杆菌在害虫防治上的应用1、杀虫范围苏云金芽孢杆菌类的各变种对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等350余种昆虫有不同程度的防治效果，但主要应用于防治下列害虫：●（1）经济作物类：棉铃虫、红铃虫、造桥虫、烟青虫；●（2）蔬菜类：菜青虫、小菜蛾、菜螟；●（3）粮食作物类：二化螟、三化螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟，玉米螟等，●（4）果树类：松毛虫、桃小食心虫、尺蠖、大袋蛾，卷叶蛾等。第五十八页，共六十五页，2022年，8月28日2、苏云金杆菌的使用方法（1）