高频电刺激下丘脑后核后大鼠僵直和运动能力变化,神经病学论文

高频电刺激下丘脑后核后大鼠僵直和运动能力变化,神经病学论文帕金森病〔Parkinsonsdisease,PD〕是一种中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，以震颤、僵硬、运动延迟缓慢和姿势平衡障碍为主要特征。脑深部刺激〔deepbrainstimulation,DBS〕被以为是当前治疗帕金森病的最佳方式方法，根据不同的异常感觉和状态选择相应地靶点，华而不实常用的刺激靶点有丘脑底核〔subthalamicnu-cleus,STN〕，苍白球内侧部〔globuspallidusinternal,GPi〕和丘脑腹中间核〔Vim〕。然而，这些靶点对于帕金森病的运动不能〔akinesia〕均效果欠佳。下丘脑后核〔posteriorhypothalamicnucleus,PH〕与运动皮层、丘脑、小脑、间脑以及脊髓存在广泛的纤维联络，在行为的组织经过中具有重要作用。有实验表示清楚损毁下丘脑后核可导致动物运动不能。本实验利用氟哌啶醇致僵硬大鼠模拟帕金森病的运动不能，通过高频电刺激下丘脑后核〔PH〕，观察大鼠僵硬和运动能力的变化，探寻求索PH在帕金森病中的作用，进而讨论PH在DBS治疗PD的中潜在的应用价值，拓宽现有的DBS刺激靶点，为临床应用提供实验根据。1、材料和方式方法1.1实验动物健康成年Sprague-Dawley〔SD〕雄性大鼠24只购于第四军医大学实验动物中心，体重280g20g。平静环境饲养，室温221℃，人工昼夜节律〔12h/12h〕，自由取食饮水。1.2实验分组及给药途径将大鼠完全随机分为3组，每组8只，即对照组〔给予等体积生理盐水〕，假刺激组〔给予1mg/kg氟哌啶醇,PH置入电极不刺激〕，刺激组〔给予1mg/kg氟哌啶醇，PH130Hz，波宽60s，强度100A的高频电刺激〕。每组按大鼠每公斤体重2mL腹腔注射给予生理盐水或氟哌啶醇。1.3主要试剂与仪器氟哌啶醇〔美国Sigma〕，克紫〔美国Sigma〕，氨苄青霉素〔哈药集团〕，水合氯醛〔上海山浦化工〕，玻璃离子体水门汀〔上海青浦尼康齿科器械厂〕，立体定向仪〔深圳瑞沃德68025〕，微型电动颅钻〔深圳瑞沃德〕，跑步机〔美国PanlabLE8706〕，双极刺激电极〔美国RhodesSNEX-100〕，刺激器〔日本NihonKohd-enSEN-3301〕，冰冻切片机〔德国LeicaCM1950〕。1.4PH电极置入用7%水合氯醛成功麻醉大鼠后，以俯卧位将头部定于立体定向仪上，常规去毛发、消毒，切开始皮约10mm,剥离皮下组织及骨膜，常规止血，用双氧水清理颅骨外表，清楚明晰暴露前后囟，调整大鼠门齿固定器使前后囟在同一水平面上，参照Paxi-nos等大鼠脑立体定位图谱，确定双侧PH位置(AP：-3.8mm，ML:0.2mm,DV:-7.6mm)。用微型电动颅钻钻透颅骨，以注射器针头轻轻将硬脑膜扎破，双侧置入双极刺激电极，其周围置入不锈钢螺丝4个，用牙科水泥固定。术后给予肌肉注射青霉素〔10万U/kg,2次/d〕3d抗感染，单笼饲养，恢复一周。1.5行为学检测大鼠腹腔给予氟哌啶醇〔1mg/kg〕30min后，分别利用爬杆试验〔bartest〕和跑步机试验〔treadmilltest〕评价大鼠的僵硬程度和运动能力。爬杆试验：垂直地将大鼠前肢置于一根离实验台10cm、水平放置的金属杆上，后肢置于实验台上，记录大鼠保持垂直体位、至少有一前肢在杆上的时间〔潜伏期latency〕。潜伏期大于15s认定为僵硬，最长潜伏期设定为180s。跑步机试验：跑道坡度为0，电击电流为0.4mA,跑步程序为从跑步机最小速度5cm/s开场，依次调速至10,15,20,30,50,70cm/s，每档速度持续时间为2min，随后休息2min，直到大鼠累积电击时间超过30s,停止试验，比拟组间大鼠平均速度和总跑动路程。1.6电极位置组织学定位行为学检测完毕后，大鼠经水合氯醛深度麻醉，通过双侧PH刺激电极给予直流电〔0.2mA,10s〕标记刺激电极尖端位置。常规灌流、固定、脱水，行连续冠状冰冻切片〔20m〕，用临时配制地0.01%克紫进行尼氏染色〔Nisslsstaining〕，光镜下观察，凡电极尖端不在下丘脑后核范围内的不纳入后续统计分析。1.7统计方式方法用SPSS17.0统计软件进行比拟分析，潜伏期、平均速度、总跑动距离以XS表示。组间差异采用单因素方差分析，P﹤0.05为差异具有统计学意义。2、结果2.1电极位置组织学定位如此图1所示，对照大鼠脑立体定向图谱可知刺激电极尖端位于PH范围内，电极周围可见胶质细胞浸染呈深染。2.2PH刺激对大鼠僵硬的影响对照组大鼠均在5s内爬下金属杆，平均潜伏期为〔2.631.3〕s，无僵硬。假刺激组和刺激组均产生僵硬，其潜伏期分别为〔167.8817.88〕、〔77.521.27〕s。3组间比拟差异具有统计学意义〔F=212.36，n=8,P=0.000〕，刺激组潜伏期显著短于假刺激组〔P=0.000〕，仍然长于正常对照组〔P=0.000〕，提示PH高频电刺激可部分逆转氟哌啶醇致僵硬作用(见图2)。2.3PH刺激对大鼠运动能力的影响。对照组大鼠最大跑动速度可达70cm/s，平均跑动速度为(24.552.89)cm/s，假刺激组和刺激组平均跑动速度分别为〔5.780.90〕和〔12.723.66〕cm/s，3组间比拟差异具有统计学意义〔F=95.75，n=8,P=0.000〕。与假刺激组比拟，刺激组平均速度显著提高〔P=0.000〕，但仍然低于正常对照组〔P=0.000〕(见图3)。相应地，对照组大鼠跑动路程为〔189.5134.17〕m，假刺激组和刺激组跑动路程分别为〔8.064.35〕m和〔98.6196.75〕m，3组间比拟差异具有统计学意义〔F=18.73，n=8,P=0.000〕。与假刺激组比拟，刺激组跑动路程显著提高〔P=0.006〕，但仍然低于正常对照组〔P=0.006〕〔见图4〕。以上表示清楚大鼠腹腔注射氟哌啶醇后运动能力显著下降，给予PH核高频电刺激可部分逆转氟哌啶醇的作用。3、讨论脑深部刺激〔DBS〕自应用于帕金森病治疗以来，因其非毁坏性、可逆性，确切的疗效，较少的副作用和并发症，越来越遭到人们的认可，被以为是当前治疗帕金森病的最佳方式方法。根据患者主要异常感觉和状态的不同选择相应的靶点，如丘脑底核〔subthala-micnucleus,STN〕，苍白球内侧部〔globuspallidusinternal,GPi〕和丘脑腹中间核〔Vim〕等。STN当前被以为是DBS的最理想靶点，电刺激STN对于震颤和僵硬效果最好，对运动缓慢和异动症则效果不佳；GPi的DBS对左旋多巴所致的运动障碍效果最为被肯定，而对于震颤的作用远不如STN和Vim；Vim作为最早应用于临床的DBS治疗靶点对于震颤的效果显著。由此可知，单一的靶点刺激往往无法完全缓解所有的异常感觉和状态，每个靶点都具有其局限性，这就有必要寻找更多更好的潜在治疗靶点。当前，对于下丘脑后核〔PH〕的功能认识特别有限，从纤维联络上看,PH与小脑、运动相关的丘脑和皮层，间脑和下丘脑运动相关区域，脑干运动相关区域以及脊髓存在广泛的联络；从神经元性质上来看，PH绝大部分的神经元为谷氨酸能神经元，其投射为兴奋性投射，这与STN神经元较为类似。氟哌啶醇致僵硬和运动不能常被用于模拟帕金森病综合征，与脑内立体定向注射6-OHDA的帕金森病动物模型相比，该模型具有操作简单、耗时短、运动不能异常感觉和状态明显等优势。爬杆试验的基本原理为让大鼠处于一种难受的姿势，即将大鼠前肢放置于离试验平台10cm高的金属杆上，正常情况下，大鼠将很快做出调整，而腹腔注射氟哌啶醇后，急性阻断脑内黑质纹状体多巴胺能传递使大鼠发生僵硬，难以短时间内做出姿势调整。类似地，跑步机试验，是将大鼠置于传输带，被动地活动，一旦活动速度跟不上传输带的速度，将被传输带远端的电栅栏电击，可评价大鼠的运动能力。本研究通过高频电刺激PH观察氟哌啶醇致运动不能大鼠运动能力的改变，旨在探寻求索PH在帕金森病中的作用，结果显示PH高频电刺激可显著逆转氟哌啶醇致大鼠僵硬和运动能力下降，提示PH是DBS治疗帕金森病的潜在靶点。当前DBS作用机制的研究绝大部分是通过DBS刺激STN、GPi以及Vim进行的。以往对于DBS作用机制的解释强调DBS对神经元、神经核团的兴奋或抑制作用，当下越来越多的证据表示清楚DBS的作用