高速逆流色谱(周五)课件

高速逆流色谱原理

高速逆流色谱

是

20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相

逆流色谱优点A无固相载体，避免了有效成分不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；B粗提物可进样分离，，有机溶剂消耗少，无损失、高效、快速和制备量大等优点;C与HPLC相比，HSCCC进样量较大，最多可达几克，是HPLC的104-105

倍;D与常压和低压色谱相比，HSCCC的分离能力强，经过1次分离就可以得到1个甚至多个单体，并且分离时间短。液滴逆流色谱(DCCC)缺点:流动相流速低，每小时只有十几毫升，需要几十小时才能完成一次几个组分的分离收集器进样器溶剂泵约300根管柱上行法收集器

进样器溶剂泵约300根管柱下行法分离原理：基于流体动力学原理

（1）假设上图是一个充满水的两端用橡皮塞封闭的螺旋橡圈，让一个石子和一个空气泡从左端进入管中，由于两者与水的密度不同，因此小石子处于螺旋管底部，而空气泡处于顶部，按图所示慢慢旋转螺旋管，则空气泡和小石子皆从左向右移动，据此我们定义称螺旋管左端为尾端，右端为首端（2）如果在此充满水的螺旋管的左边加入一滴与水互补相溶的氯仿，由于氯仿的密度比水大，这滴氯仿就沉在螺旋管的下面，慢慢旋转螺旋管，氯仿也会从左向右移动。如果将螺旋管里面的水换成氯仿，让一滴水从左边进入螺旋管，则由于水密度比氯仿小，这一滴水就浮在螺旋管的上面，慢慢转动螺旋管，则水滴也会从左向右移动。（3）如果在螺旋管中同时各充满50%的氯仿和水，两端仍用橡皮塞密封，当按图所示旋转螺旋管时，则互不相溶的两相都从左向右移动，相互竞争。在经历一段时间并达到平衡之后，氯仿以小的液滴均匀的分散在螺旋管中，如果此时停止旋转螺旋管，让其静置，则可以观察到螺旋管的每一圈中，水在上面，氯仿在下面，并各占50%。

以上都是螺旋管在慢速转动的情况下螺旋管中两相的特性，其主要作用来自于重力，，慢速转动的离心力可以忽略不计（5）由于高速旋转的螺旋管中互不相容的两相具有上述性质，因此当我们将螺旋管的左端与恒流泵相连，将水相首先充满螺旋管并高速旋转时，管中水相将向恒流泵的方向移动，但由于其输液出口由单向阀控制，阻止了水相的左移而被固定在螺旋管中，此时我们再用恒流泵以一定的速度从左边泵入氯仿，由于在此两相中氯仿有向螺旋管右侧移动的趋势，氯仿相就能以小液滴的方式穿过螺旋管中的水相。如果将此系统作为分配色谱系统，则水起到了固定相的作用，氯仿就是移动相。高速逆流色谱操作（一）两相溶剂的选择（二）样品溶液的制备（三）分离（四）检测

（一）两相溶剂的选择

1.两相溶剂（1）选择的溶剂系统需要能分成两相，这是逆流色谱进行分离的先决条件（2）较快的分层时间，一般不超过30秒（3）两相溶剂可以是二组分或者多组分，最好分层后两相体积大致相等，有利于节省溶剂。（4）溶剂系统不造成样品的分解或变性，应该具有相当的溶解度2.固定相的足够高保留在仪器工作时，由于移动相的泵入，总是要从螺旋管中排挤出一部分固定相，一般情况下螺旋管中保持的固定相越多，样品的分离效果越好，理想的溶剂系统固定相的保留百分数往往大于50%,其保留百分数主要受溶剂种类及各组分之间的比例影响，还受仪器参数β和转数大小的影响3.样品在溶剂中合适的分配系数样品在两项中适当的分配系数是成功的关键K=C固/C流，研究表明，合适的分配比在0.5-2的范围内，k小于0.5则色谱峰出得太快，达不到的分离效果，k大于2则色谱峰出得慢，浪费大量溶剂分配系数K可以通过HPLC进行简单测定。对于一个待分离物首选氯仿-甲醇-水体系（2:1:1），如果分配系数在0.2-5可以通过改变三者的比例达到较佳的溶剂体系。如果K小于0.2则采用正己烷-乙酸乙酯/甲醇-水，如果分配比还比较小，则用正己烷/甲醇-水体系。如果K大于5则考虑用乙酸乙酯-正丁醇-水或者正丁醇-水体系。（皂苷、强心苷、黄酮苷、多酚类等）（香豆素、醌类、苯丙素、生物碱、黄酮等）（萜类、甾体、脂肪酸等）（三）分离

（1）先将两相溶剂系统预平衡，混合，振摇，静置，分层，收集上下相（2)量取等量的上下相，溶解样品（3)把固定相泵入线圈，大概10mL/min，观察是否有液体放出