DNA的复制损伤与修复-f课件

Replicationanddamagerepair第二章DNA的复制、损伤和修复

Replicationanddamagerepair第第一节DNA的复制(Replication,DNAbiosynthesis)

指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。哺乳动物的细胞周期第一节DNA的复制(Replication,DNAb（一）半保留复制

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。一、DNA复制特征意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和

F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.半保留复制证据DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Mesel（以原核生物大肠杆菌为例）原料：dNTP，Mg++双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物

解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。与复制有关的酶和因子（以原核生物大肠杆菌为例）与复制有关的酶和因子复制的起始点与方向

亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动复制叉亲代DNA分子3’5’3’5’复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点

原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列

真核：多个起始点ori复制的起始点与方向亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。

13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键

9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。

dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。（二）复制子基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子（二）复制子

一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。

原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）①.原核细胞：染色体和质粒固定起点双向复制，②.

真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。（三）复制方向DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个DNA的复制损伤与修复-f课件复制方向DNA合成的方向单向、双向？

1个起始点复制方向DNA合成的方向单向、双向？1个起始点复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims实验)

将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B

）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A

）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。环状DNA的复制ABCABC复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims实验)双向复制oriori复制子oriori

真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段以起始点为中心，向两个方向进行复制双向复制oriori复制子oriori真核生物两个相邻复多个起始点多个起始点二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白质因子二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶（topoisomeraseI、II）

3.单链DNA结合蛋白(SSB)解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶

DNA解旋酶(helicase)（解链酶）

功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP，

作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。

种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一种沿模板5'-3'方向移动，rep蛋白沿模板3'-5'方向移动。5′3′5′3′repDNA解旋酶(helicase)（解链酶）5′3′5′3′拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺DNA的复制损伤与修复-f课件

首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。

另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。Ⅰ型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发

由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。

两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。Ⅱ型拓扑异构酶由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶II抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解SSB单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链DNA聚合酶（DNA-pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）

真核生物有多种：

DNA-pol

、、、、…

原核生物有3种：

DNA-polⅠ、Ⅱ、ⅢDNA聚合酶（DNA-pol）真核生物有多种：原核生物有3种DNA聚合酶功能5´3´聚合作用5´3´外切酶3´5´外切酶活性DNA聚合酶功能5´3´聚合作用大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++1校读,修复1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50复制100000特性不清填补缺口50大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNADNA聚合酶Ⅲ引物酶(Primase)和引发体

5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基础上进行RNA引物5´3´5´3´引物酶(Primase)和引发体5´5´催化RNA引物合成DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、Dna

小结主要成员

主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接小结主三、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’三、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH35+dN第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的终止第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制一复制的起始(一)DNA解成单链

由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉

倒Y一复制的起始(一)DNA解成单链由特定蛋白质识别复(二)引发体的生成

解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解旋酶(二)引发体的生成解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5（三）RNA引物的合成

5´5´RNA引物5´3´5´3´（三）RNA引物的合成5´5´RNA引物5´3´5´3´参与复制起始的蛋白因子

名称

功能DnaA蛋白辨认起始点

解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链DnaC协助解螺旋酶

引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链OriCE.coli复制起始点参与复制起始的蛋白因子名称功能DnaA蛋白领头链的合成领头链的合成

引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3’

末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长

二复制的延长3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH

5’-DNA-O-P-N-OHPP++

dNTPs引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase冈崎片断RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5复制过程简图复制过程简图半不连续复制(semi-discontinuousreplication)领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)半不连续复制(semi-discontinuousrepl555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP5三复制的终止

原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。三复制的终止

原核生物基因是环状DNA，双向复制第四节、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。第四节、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期DNA的复制损伤与修复-f课件需要引物

DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’OH末端作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。

RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。双向复制

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

需要引物

半不连续复制（semidiscontinuousreplication）

由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’→5’方向的母链作为模板指导新的链以5’→

3’方向连续合成;另一股以5’→

3’为方向的母链则指导新合成的链以5’→

3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。半不连续复制由于DNA聚合酶只能以5’PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解释PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前导链随从链岗崎片段半不连续复制

以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。

5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’前导链随从前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。随从链：在引物的3’端按5’→3’方向不连续合成的DNA链。冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNADNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3’OH以3’,5’磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi

。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5’3’

有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III—聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙

有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有从5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用与聚合酶III相似有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性；有从3’——5’外切酶的活性聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA连接酶（ligase）

将不连续的DNA片段以3’，5’磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATPDNA连接酶（ligase）将不连续的DNA片段以3’，复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DN真核生物端粒的形成端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成可重复数十次至数百次。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。

端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。真核生物端粒的形成1.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。

2.结构特点：（1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。（2）末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序

列。1.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端粒（telomere）

染色体线性DNA分子末端通常膨大成粒状共同的结构特征:

富含TG

短重复序列维持染色体稳定端粒酶（telomerase）

RNA-蛋白质复合体逆转录酶延长末端DNA链进行端粒（telomere）3.功能：（1）维持染色体的稳定性（2）维持DNA复制的完整性

4.端粒酶：由RNA和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性3.功能：端粒酶的催化延长作用爬行模型端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工DNA聚合酶复制子链进一步加工第五节、DNA的几种复制方式（1）、

直线双向复制单点双向，T7噬菌体多点双向，真核染色体DNA（2）、θ型复制：环状双链DNA，对称复制，单向或双向（E.coli.）（3）、

滚环复制：环状单链DNA，Φx174（4）、

D环复制（取代环复制）：不对称复制，线粒体、叶绿体DNA。两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。第五节、DNA的几种复制方式DNA的复制损伤与修复-f课件线性DNA的复制成环或多连体复制：如T4,λ噬菌体多连体复制：两个5´有空缺的分子通过3´凸出的重复序列互补，DNApolI从3´补齐这个空缺，连接酶连接裂缝，再用限制性内切酶产生3´凹端，polI便可填补空缺产生新链。线性DNA的复制成环或多连体复制：如T4,λ噬菌体末端二级结构：发夹结构或十字形交叉作为引物端粒复制蛋白质介导末端连接蛋白质提供3´-OH，如Ф29，腺病毒3´端有-80KDa的特异性蛋白（TP)，以Ser的OH基团形成磷酸二酯键，作为引物进行链取代方式复制。末端二级结构：发夹结构或十字形交叉作为引物环状DNA的复制θ复制滚环复制D-环复制环状DNA的复制θ复制DNA的复制损伤与修复-f课件滚环复制和D环复制滚环复制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。滚环复制和D环复制滚环复制(rollingcircler35553335'滚环复制的过程3-OH5-P5'533535553335'滚环复制的过程3-OH5D环复制(D-loopreplication)：是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)：是线粒体第六节DNA的损伤一、DNA的损伤（突变）由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。（一）引起突变的因素1．自发因素(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。第六节DNA的损伤2．物理因素

由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

2．物理因素3．化学因素(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4)碱基类似物：如5-FU等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

3．化学因素（二）DNA突变的类型碱基的转换

（二）DNA突变的类型二、DNA损伤的修复

DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

二、DNA损伤的修复（一）直接修复1．光复活（lightrepairing）

这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：

光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从DNA上解离。

（一）直接修复其修复过程为：2．转甲基作用

在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。3．直接连接

DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

2．转甲基作用（二）取代修复1．切除修复(excisionrepairing)

这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。⌒可修复TT，电离辐射，某些化学诱变剂造成的DNA结构的破坏

参加的酶有：特异的核酸内切酶；外切酶；聚合酶；连接酶。（二）取代修复DNA的复制损伤与修复-f课件DNA的复制损伤与修复-f课件2．重组修复(recombinationrepairing)

这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。(重组修复，复制后修复

)

2．重组修复(recombinationrepairing3．SOS修复

由DNA损伤或抑制复制的处理所引起的一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。

DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。

3．SOS修复DNA损伤与药物评价1.遗传毒性试验遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置。遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一。在检测这些类别损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。DNA损伤与药物评价1.遗传毒性试验实验方法

Ames试验（污染物致突变性检测）是检测化学物质基因突变的常用方法。沙门氏菌回复突变试验鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。实验方法

Ames试验（污染物致突变性检测）沙门氏菌回复在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验DNA的复制损伤与修复-f课件TK基因突变试验

TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidinekinase，TK）基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端；在小鼠则定位于11号染色体。故TK基因的突变属于常染色体基因突变。TK基因突变试验TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物（如三氟胸苷，即TFT——trifluorothymidine），则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计算突变频率，以判定受试物的致突变性。TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR）生成胸苷试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等。其基因型均为tk+/-。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋转基因小鼠基因突变试验转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变,比较不同组织(包括生殖腺)的突变率,确定靶器官,对诱发的遗传改变作精确分析等。国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物,其中3种已投入商品化生产,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和/或Lacl作为诱变的靶基因。转基因小鼠基因突变试验转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下反向限制性酶切位点突变分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM)

iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变，这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测:小鼠分别口服N-乙基N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的Apa→Ava位点反向突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%,2-AAF使肝组织突变的发生率为25%,这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度,进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。它具有灵敏度高、快速、操作简便、以及突变检测部位明确等优点,是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。反向限制性酶切位点突变分析法(inverserestrict但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的DNA突变。根据文献资料分析,化合物致突的发生具有一定的规律性,即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如,烷化剂和芳香胺类易使一连串鸟嘌呤(G)3′端G发生突变,这可能与该部位电荷密集有关,多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律;CpG二核苷常常是DNA加成物致突变作用部位,所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义,而CpG突变常引发某些固定酶切位点的变化。很显然,iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。

但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的D检测染色体和染色体组畸变

微核试验

微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。是检测化学物质染色体损伤的基本方法。检测染色体和染色体组畸变

微核试验DNA的复制损伤与修复-f课件方法：最常用的是啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。以受试物处理啮齿类动物，然后处死，取骨髓，制片、固定、染色，于显微镜下计数PCE中的微核。方法：染色体畸变试验染色体畸变试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法。染色体畸变试验荧光原位杂交(FISH)技术荧光原位杂交最早由Bauman(1980)建立,后由Lucas(1989)首先应用于染色体畸变分析。其原理是按检测目标准备恰当的DNA序列作为探针,并用生物素标记,对载玻片上待测标本中的DNA杂交,最后通过杂交位点的荧光观察染色体结构或数目的改变。荧光原位杂交(FISH)技术荧光原位杂交最早由Bauman应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针可在体内检测4种类型的细胞遗传学终点。1检测中期细胞染色体畸变。2应用亚染色体区域的探针检测间期染色体断裂和非整倍体。3应用中心粒探针和/或抗着丝点抗体检测微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST间接免疫荧光法,以及小鼠次要和主要卫星DNA探针,在小鼠骨髓细胞证明了受试物引起微核的来源。4哺乳动物精子非整倍体检测。

应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针可在体内检测4种类型的检测DNA原始损伤单细胞凝胶电泳技术单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。检测DNA原始损伤单细胞凝胶电泳技术DNA的复制损伤与修复-f课件Replicationanddamagerepair第二章DNA的复制、损伤和修复

Replicationanddamagerepair第第一节DNA的复制(Replication,DNAbiosynthesis)

指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。哺乳动物的细胞周期第一节DNA的复制(Replication,DNAb（一）半保留复制

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。一、DNA复制特征意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和

F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.半保留复制证据DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Mesel（以原核生物大肠杆菌为例）原料：dNTP，Mg++双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物

解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。与复制有关的酶和因子（以原核生物大肠杆菌为例）与复制有关的酶和因子复制的起始点与方向

亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动复制叉亲代DNA分子3’5’3’5’复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点

原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列

真核：多个起始点ori复制的起始点与方向亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。

13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键

9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。

dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。（二）复制子基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子（二）复制子

一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。

原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）①.原核细胞：染色体和质粒固定起点双向复制，②.

真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。（三）复制方向DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个DNA的复制损伤与修复-f课件复制方向DNA合成的方向单向、双向？

1个起始点复制方向DNA合成的方向单向、双向？1个起始点复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims实验)

将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B

）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A

）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。环状DNA的复制ABCABC复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Caims实验)双向复制oriori复制子oriori

真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段以起始点为中心，向两个方向进行复制双向复制oriori复制子oriori真核生物两个相邻复多个起始点多个起始点二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白质因子二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶（topoisomeraseI、II）

3.单链DNA结合蛋白(SSB)解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶

DNA解旋酶(helicase)（解链酶）

功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP，

作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。

种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一种沿模板5'-3'方向移动，rep蛋白沿模板3'-5'方向移动。5′3′5′3′repDNA解旋酶(helicase)（解链酶）5′3′5′3′拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺DNA的复制损伤与修复-f课件

首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。

另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。Ⅰ型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发

由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。

两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。Ⅱ型拓扑异构酶由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶II抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解SSB单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链DNA聚合酶（DNA-pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）

真核生物有多种：

DNA-pol

、、、、…

原核生物有3种：

DNA-polⅠ、Ⅱ、ⅢDNA聚合酶（DNA-pol）真核生物有多种：原核生物有3种DNA聚合酶功能5´3´聚合作用5´3´外切酶3´5´外切酶活性DNA聚合酶功能5´3´聚合作用大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++1校读,修复1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50复制100000特性不清填补缺口50大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA分子量DNADNA聚合酶Ⅲ引物酶(Primase)和引发体

5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基础上进行RNA引物5´3´5´3´引物酶(Primase)和引发体5´5´催化RNA引物合成DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、Dna

小结主要成员

主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接小结主三、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’三、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH35+dN第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的终止第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制一复制的起始(一)DNA解成单链

由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉

倒Y一复制的起始(一)DNA解成单链由特定蛋白质识别复(二)引发体的生成

解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解旋酶(二)引发体的生成解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5（三）RNA引物的合成

5´5´RNA引物5´3´5´3´（三）RNA引物的合成5´5´RNA引物5´3´5´3´参与复制起始的蛋白因子

名称

功能DnaA蛋白辨认起始点

解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链DnaC协助解螺旋酶

引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链OriCE.coli复制起始点参与复制起始的蛋白因子名称功能DnaA蛋白领头链的合成领头链的合成

引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3’

末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长

二复制的延长3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH

5’-DNA-O-P-N-OHPP++

dNTPs引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase冈崎片断RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5复制过程简图复制过程简图半不连续复制(semi-discontinuousreplication)领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)半不连续复制(semi-discontinuousrepl555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP5三复制的终止

原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。三复制的终止

原核生物基因是环状DNA，双向复制第四节、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。第四节、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期DNA的复制损伤与修复-f课件需要引物

DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’OH末端作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。

RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。双向复制

DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

需要引物

半不连续复制（semidiscontinuousreplication）

由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’→5’方向的母链作为模板指导新的链以5’→

3’方向连续合成;另一股以5’→

3’为方向的母链则指导新合成的链以5’→

3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。半不连续复制由于DNA聚合酶只能以5’PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解释PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前导链随从链岗崎片段半不连续复制

以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。

5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’前导链随从前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。随从链：在引物的3’端按5’→3’方向不连续合成的DNA链。冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNADNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3’OH以3’,5’磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi

。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5’3’

有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III—聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙

有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有从5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用与聚合酶III相似有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性；有从3’——5’外切酶的活性聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/KlDNA连接酶（ligase）

将不连续的DNA片段以3’，5’磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATPDNA连接酶（ligase）将不连续的DNA片段以3’，复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DN真核生物端粒的形成端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成可重复数十次至数百次。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。

端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。真核生物端粒的形成1.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。

2.结构特点：（1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。（2）末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序

列。1.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端粒（telomere）

染色体线性DNA分子末端通常膨大成粒状共同的结构特征:

富含TG

短重复序列维持染色体稳定端粒酶（telomerase）

RNA-蛋白质复合体逆转录酶延长末端DNA链进行端粒（telomere）3.功能：（1）维持染色体的稳定性（2）维持DNA复制的完整性

4.端粒酶：由RNA和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性3.功能：端粒酶的催化延长作用爬行模型端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工DNA聚合酶复制子链进一步加工第五节、DNA的几种复制方式（1）、

直线双向复制单点双向，T7噬菌体多点双向，真核染色体DNA（2）、θ型复制：环状双链DNA，对称复制，单向或双向（E.coli.）（3）、

滚环复制：环状单链DNA，Φx174（4）、

D环复制（取代环复制）：不对称复制，线粒体、叶绿体DNA。两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。第五节、DNA的几种复制方式DNA的复制损伤与修复-f课件线性DNA的复制成环或多连体复制：如T4,λ噬菌体多连体复制：两个5´有空缺的分子通过3´凸出的重复序列互补，DNApolI从3´补齐这个空缺，连接酶连接裂缝，再用限制性内切酶产生3´凹端，polI便可填补空缺产生新链。线性DNA的复制成环或多连体复制：如T4,λ噬菌体末端二级结构：发夹结构或十字形交叉作为引物端粒复制蛋白质介导末端连接蛋白质提供3´-OH，如Ф29，腺病毒3´端有-80KDa的特异性蛋白（TP)，以Ser的OH基团形成磷酸二酯键，作为引物进行链取代方式复制。末端二级结构：发夹结构或十字形交叉作为引物环状DNA的复制θ复制滚环复制D-环复制环状DNA的复制θ复制DNA的复制损伤与修复-f课件滚环复制和D环复制滚环复制(rollingcirclereplication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。滚环复制和D环复制滚环复制(rollingcircler35553335'滚环复制的过程3-OH5-P5'533535553335'滚环复制的过程3-OH5D环复制(D-loopreplication)：是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)：是线粒体第六节DNA的损伤一、DNA的损伤（突变）由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。