光度测定法BE检查技术

光度测定法BET检查技术湛江安度斯生物有限公司2009年3月1、光度测定法方法学分类2、光度测定法原理3、动态比浊法BET4、终点比色法BET2023/1/521、光度测定法方法学分类光度测定法（定量法检测）浊度法显色法动态浊度法终点浊度法动态显色法终点显色法(比浊法)(比色法)2023/1/532、光度测定法原理光电转换原理光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。入射光反应混合物透射光光电池I透光容器2023/1/54设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It

定义1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。定义2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至升高。选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。T(分)IsItIeI2023/1/55TAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线)以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：Rt（%）T（分）动态曲线100孕育期反应期结束2023/1/56TAL与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线)以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：ODT（分）动态曲线0孕育期反应期结束2023/1/57动态曲线的特点把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分别与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：C3Rt（%）T（分）C2C1分析动态曲线可看出：内毒素浓度越高，孕育期越短；内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；内毒素浓度越高，进入结束期越快。2023/1/58光度测定法BET试验的相关变量C3100Rt（%）T（分）C2C1相关变量：

内毒素浓度(C)

透光度(Rt或OD)

反应时间(T)2023/1/591）动态法原理固定透光度(Rt)，建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线），用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（Rt）的时间。回归分析Rt%预设透光度值R0T1T2T392100T(分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立标准曲线2023/1/510（2）测测定定样样品品内内毒毒素素浓浓度度（（Cs）用鲎鲎试试剂剂与与未未知知内内毒毒素素含含量量的的供供试试品品(S)反应应，，得得到到反反应应时时间间Ts，比比对对C-T关系系的的标标准准曲曲线线，，可可得得出出供供试试品品的的内内毒毒素素含含量量Cs。比对对标标准准曲曲线线TsT(分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922022/12/29112）终点点法原原理固定反反应时时间（（T），建建立内内毒素素浓度度与透透光度度关系系的标标准曲曲线（（C-Rt曲线）），用用供试试品的的透光光度比比对标标准曲曲线，，得出出供试试品的的内毒毒素浓浓度。。Rt(%)T(分)C1C2C3100R1R2R3预设反反应终终止时时间T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-K·C回归分分析（1）建立立标准准曲线线2022/12/2912（2）测定定样品品内毒毒素浓浓度（（Cx）用鲎试试剂与与未知知内毒毒素含含量的的供试试品（（X）反应应，得得到透透光度度值Rx，比对对C-Rt关系的的标准准曲线线，可可得出出供试试品的的内毒毒素含含量Cx。CxToT(分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-K·CRxCx比对标准曲线2022/12/29133、动态态比浊浊法试验仪仪器及及器具具动态微微孔平平板仪仪或试试管仪仪BET软件微孔平板、、反应试管管等2022/12/2914英国LabKinetics公司ATi动态试管仪仪,96孔湛江安度斯斯公司开发发的BET专用软件“生物探针针-2002”2022/12/2915美国CharlesRiverEndosafe便携式检测测系统（PTS）美国BioTek公司超级酶酶标仪，ELx808IU,使用96孔微孔板2022/12/2916LKM细菌内毒素素动态试管管仪制造商：英英国莱伯金金耐特公司司（LabKineticsLtd.）世界上第一一台动态试试管仪的生生产商目前世界上上销量最大大的动态试试管仪已经取得医医疗器械许许可证完善的售后后服务仪器特点：：1、体积小巧巧，占用空空间小；2、恒温性能能、光学性性能精密，，各孔温度均均在37±0.2℃，这是国内同同类仪器无无法达到的。3、配有专业业的、操作作简单的软软件系统。2022/12/2917ELx808IU型动态酶酶标仪制造商：：美国伯伯腾公司司（BioTek）功能强大大的细菌菌内毒素素检测仪仪器丰富的面面板操作作及数据据分析，，无需电电脑可独独立操作作可使用多多个波长长同时分分析2022/12/2918动态比浊浊法试验验程序1、器具的的准备2、验证试试验标准曲线线的可靠靠性试验验干扰试验验3、检查法法2022/12/29191）试验器器具的准准备器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径8×75mm或10×75mm）稀释容器大口径玻璃试管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及无热原吸头等其他试管架、酒精灯、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记纸等凡是与供供试品或或反应试试剂接触触的器具具，必须须经除热热原处理理。通常常玻璃器器具需经经250℃℃、60分钟的干干烤处理理2022/12/29202）标准曲曲线的可可靠性试试验试验目的的验证实验验室的条条件是否否满足BET试验的要要求验证实验验人员的的实验技技能是否否满足BET试验验的的要要求求验证证实实验验所所用用试试剂剂（（包包括括鲎鲎试试剂剂、、内内毒毒素素标标准准品品、、BET水等等））是是否否满满足足BET试验验要要求求2022/12/29211、、试剂剂2022/12/29Page22试剂名称厂家装量规格动态浊度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/ml~0.03EU/ml内毒素标准品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml2、反应项项目将标准内毒毒素制备成成至少3个浓度的稀稀释液，相相邻浓度间间稀释倍数数不得大于于10，最低浓度度不得低于于所用鲎试试剂的标示示检测限实验前，先先预热动态态仪，使其其达到反应应温度项目平行管阴性对照溶液(D)OOOOOOOOOOO内毒素标准溶液（C）(EU/mL)0.030.252.02022/12/29233、溶液C的制备E1003.6mlWE100.4ml3.2mlWE20.8ml2.8mlWE0.250.4ml2.8mlWE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分钟E10E2E0.25E0.03CSE/E1002022/12/29244、鲎试剂剂的准备①取TAL1支，用砂轮轮在安瓿颈划痕，擦拭拭后从安瓿瓿颈处折断断（避免玻玻璃屑落入入安瓿内））；②②用刻度度吸管或移移液器准确确吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入入安瓿内，，轻轻摇匀匀，使内容容物全部溶溶解（避免免产生气泡泡）；③取反应应试管11支，按2.0EU/ml、0.25EU/ml、、0.03EU/ml各浓度平行行3管，NC平行2管标标记；2022/12/29255、、软软件件系系统统的的设设置置进入入动动态态仪仪系系统统软软件件，，根根据据试试验验要要求求，，设设置置相相关关参参数数，，如如反反应应时时间间、、预预设设透透光光度度值值等等。。填写写相相关关的的实实验验参参数数，，使使软软件件进进入入待待采采集集状状态态2022/12/29266、、加加样样反反应应先将将复复溶溶好好的的鲎鲎试试剂剂分分装装至至各各反反应应试试管管中中，，0.1ml/管；；分别别将将反反应应溶溶液液加加入入各各相相应应反反应应管管中中，，一一般般按按照照从从低低浓浓度度到到高高浓浓度度的的顺顺序序加加样样，，首首先先加加阴阴性性对对照照溶溶液液；；加样样完完成成后后，，将将每每支支反反应应管管内内的的混混合合液液轻轻轻轻混混匀匀后后，，插插入入动动态态仪仪中中反反应应TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加样样顺顺序序从从低低浓浓度度到到高高浓浓度度2022/12/2927在动态仪仪中插入入反应试试管后，，开始数数据采集集。2022/12/29287、结果果判断药典要求求1、阴性性对照的的反应时时间应大大于标准准曲线最最低浓度度的反应应时间2、标准准曲线的的相关系系数|r|≥0.980厂家建议议值3、变异异系数CV%<10%关于相关关系数当对一组组数据作作线性回回归分析析时，以以相关系系数r表示其标标准曲线线的线性性状况，，即该组组数据的的相关状状况。当当r值为正时时，表示示该组数数据呈正正相关关关系；r值为负时时，该组组数据为为负相关关关系。。当r值的绝对对值|r|=1时，其标标准曲线线的线性性最好。。2022/12/2929试验完完成后后进行行数据据分析析2022/12/2930试验完完成后后进行行数据据分析析2022/12/2931试验完成后后进行数据据分析E0.3125E0.25E22022/12/29323）干扰扰初筛试验验目的及原理理只有在无干干扰情况下下，样品的的内毒素检检测结果才才是有效的的。通过检测从从供试品原原液到其MVD或MVC之间的稀释释液，计算算内毒素回回收率，判判断供试品品浓度对BET的干扰情况况。2022/12/2933试验步骤1、供试品品限值的确确定2、试剂的的选择3、供试品品最大有效效稀释的计计算4、反应溶溶液的制备备5、加样及及反应6、结果判判断2022/12/2934干扰扰初初筛筛试试验验举举例例供试试品品限限值值硫酸酸庆庆大大霉霉素素，，100ml/瓶，，5000U/ml；；药典典要要求求，，硫硫酸酸庆庆大大霉霉素素限限值值L=0.5EU/1000U2022/12/2935试剂剂本试试验验使使用用鲎鲎试试剂剂的的检检测测范范围围为为10~0.03EU/ml，，选择择标标准准曲曲线线浓浓度度为为2、、0.25、、0.03EU/ml试剂名称厂家装量规格动态浊度法TAL安度斯1.25ml/支10~0.03EU/ml内毒素标准品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml2022/12/2936最大大有有效效稀稀释释倍倍数数的的计计算算光度度测测定定法法中中，，供供试试品品最最大大有有效效稀稀释释倍倍数数计计算算公公式式：：MVD=cL/λλ，，其中中λ为标标准准曲曲线线最最低低点点浓浓度度本试试验验，，MVD=5000U/mlx0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（（倍））2022/12/2937各反反应应溶溶液液的的制制备备溶液液C的制制备备E1000.4ml3.6mlWE100.8ml3.2mlWE20.4ml2.8mlWE0.25S原液液0.4ml3.6mlWS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS80备用用液液0.4ml2.8mlWE0.03溶液液A的制制备备E0.50.8ml2.4mlW备用用液液2022/12/2938溶液B的制备E0.5S100.5ml0.5mlS20E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40E0.252022/12/2939加样及反应应取TAL两支，参照照标准曲线线可靠性试试验中的方方法将其复复溶；复溶鲎试剂剂后，运行行软件，使使其进入待待采集状态态；将两支复溶溶好的鲎试试剂溶液合合并在一起起，轻轻混混匀避免产产生气泡；；将鲎试剂液液分装至20支反应应试管中，，0.1ml/管；将相应的溶溶液A、B、C、D加至反应管管中，0.1mL/管，每浓度度平行2管管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0.25S40E0.25S80E0.25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2022/12/2940结果判断药典要求1、阴性对对照的反应应时间（TD）大于标准准曲线最低低浓度的反反应时间（（Tλ）2、标准曲曲线的相关关系数|r|≥0.9803、回收率率R满足：50%≤R≤200%厂家建议值值4、变异系系数CV%<10%2022/12/2941回收率率的计计算光度测测定法法试验验中，，在供试品品检查查浓度度的溶溶液中中,添加标标准曲曲线中中点或或靠近近中点点的内内毒素素浓度度,根据回回收的的内毒毒素浓浓度与与添加加的内内毒素素浓度度的比比值(回收率率R)，，判断供供试品品溶液液对试试验的的干扰扰程度度。R的计算算公式式如下下：2022/12/29Page42Ct：试验验测出出的供供试品品溶液液的内内毒素素含量量Cs：试验验测出出的加加入m标准内内毒素素的供供试品品溶液液的内内毒素素含量量m：标准准曲线线的中中点或或靠近近中点点的已已知浓浓度内内毒素素光度测测定法法规定定：当当R在50~200%之间时时，认认为在在此试试验条条件下下该供供试品品溶液液对试试验无无干扰扰。Cs-CtmR=本试验验结果果相关系系数绝绝对值值|r|=0.9949>0.980TD（>3600s）>Tλ20倍回收收率40倍回收收率80倍回收收率试验有有效试验有有效有干扰扰有干扰扰无干扰扰2022/12/29434））干干扰扰试试验验根据据干干扰扰初初筛筛试试验验结结果果，，确确定定选选择择供供试试品品的的无无干干扰扰浓浓度度选择择3批批供供试试品品进进行行干干扰扰验验证证试试验验溶液液的的制制备备方方法法与与干干扰扰初初筛筛试试验验相相同同有干干扰扰不理理想想无干干扰扰2022/12/2944溶液液的的制制备备A为稀稀释释倍倍数数不不超超过过MVD的供供试试品品溶溶液液B为加加入入m内毒毒素素且且与与A溶液液有有相相同同稀稀释释倍倍数数的的供供试试品品溶溶液液C为用用于于制制备备标标准准曲曲线线的的内内毒毒素素标标准准溶溶液液D为阴阴性性对对照照编号内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液不少于2个B标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）供试品溶液不少于2个C至少3个浓度（最低点设定为λ）检查用水每一浓度不少于2个D无检查用水不少于2个2022/12/2945反应项目目设置3批样品品都在同同一浓度度做干扰扰验证试试验每浓度平平行2管管溶液编号项目平行管D阴性对照OOC内毒素标准(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOA1S80OOB1S80E0.25OOA2S80OOB2S80E0.25OOA3S80OOB3S80E0.25OO2022/12/2946接受标准准药典要求求1、阴性性对照的的反应时时间（TD）大于标标准曲线线最低浓浓度的反反应时间间（Tλ）2、标准准曲线的的相关系系数|r|≥0.9803、各批批样品的的回收率率R满足：50%≤R≤200%厂家建议议值4、变异异系数CV%<10%2022/12/29475）检查查法（日日常检查查）根据干扰扰试验结结果，选选择无干干扰的供供试品浓浓度进行行BET日常检查查各反应溶溶液的制制备及反反应项目目设置与与干扰试试验相同同溶液编号项目平行管D阴性对照OOC内毒素标准(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOAS80OOBS80E0.25OO2022/12/2948结果判断断药典要求求1、阴性性对照的的反应时时间(TD)大于标标准曲线线最低浓浓度的反反应时间间(Tλ)2、标准准曲线的的相关系系数|r|≥0.9803、各批批样品的的回收率率R满足：50%≤R≤200%厂家建议议值4、变异异系数CV%<10%若供试品品溶液A所有平行行管的内内毒素浓浓度平均均值乘以以稀释倍倍数后，，小于规规定的内内毒素限限值，判判供试品品符合规规定，否否则判供供试品不不符合规规定无复测要要求2022/12/29494、终点点比色法法BET原理当鲎试验验的显色色反应到到达预设设的反应应终止时时间（T0)时，反应应混合液液的吸光光度值（（OD）与内毒素素浓度（（C）成正比，，利用标标准内毒毒素建立立OD-C的标准曲曲线，利利用标准准曲线定定量测定定供试品品的内毒毒素含量量。仪器分光光度度计酶标仪37℃恒恒温仪2022/12/2950试验程序1.试验验准备：仪仪器及用具具等2.确定定药品的细细菌内毒素素限值（L）3.选择择终点比色色法试剂盒盒终点比色法法鲎试剂显色基质（（底物）工作标准内内毒素（CSE）4.计算算供试品的的最大有效效稀释（MVD）或最低有效效浓度（MVC）5.标准准曲线的可可靠性试验验6.干扰扰试验（验验证）7.检查查法（日常常检查）2022/12/2951终点比色法法日常检查查举例试剂及器具具终点比色法试剂盒终点比色法试剂

显色基质（底物）

工作标准内毒素（CSE）酶标仪405nm微孔平板96孔，无热原微孔平板恒温器提供37℃恒温环境供试品（S）生理盐水，L=0.5EU/ml2022/12/2952试验步骤1、开启微孔平平板恒温器器预热2、溶液C的制备根根据试剂盒盒说明书标标准曲线浓浓度要求，，制备标准准内毒素系系列溶液，，如1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、及0.125EU/ml（λ）；3、溶液A、B的制备MVD=L/λ=0.5/0.125=4（倍）将供试品稀稀释到S2、S4（溶液A）

0.6mlS2+0.6E1.01.2mlS4E0.5（溶液B）2022/12/29534、反应项项目设置置溶液编号项目平行管D阴性对照OOC内毒素标准(EU/mL)E0.125OOE0.25OOE0.5OOE1OOAS4OOBS4E0.5OO2022/12/29545、取微孔平平板放到到37℃℃恒温器器上；每每孔加0.05ml相应溶液液（A、B、、C及D溶液），，每浓度度溶液平平行2孔孔；加样样完毕恒恒温孵育育5分钟钟*；6、复溶鲎试试剂及显显色基质质（底物物）；7、每孔加入入0.05ml鲎试剂，，恒温7分钟*；8、每孔加入入0.1ml显色基质质溶液，，恒温5分钟*；9、每孔加入入0.1ml终止液；；*此时间间根据终终点比色色试剂盒盒使用说说明书要要求确定定2022/12/295510、把微微孔孔平平板板放放入入酶酶标标仪仪中中用用405nm波长长测测吸吸光光度度值值；；11、根据据各各内内毒毒素素浓浓度度对对应应的的吸吸光光度度值值建建立立内内毒毒素素浓浓度度与与吸吸光光度度值值的的标标准准曲曲线线；；12、利用用标标准准曲曲线线计计算算A、、B溶液液的的内内毒毒素素含含量量及及供供试试品品的的回回收收率率。。此此计计算算一一般般由由仪仪器器自自动动进进行行。。判判断断实实验验的的有有效效性性与与动动态态浊浊度度法法相相同同。。2022/12/29569、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。03:52:1903:52:1903:5212/29/20223:52:19AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2203:52:1903:52Dec-2229-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。03:52:1903:52:1903:52Thursday,December29,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2203:52:1903:52:19December29,202214、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。29十十二月20223:52:19上午午03:52:1912月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月223:52上上午午12月月-2203:52December29,202216、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2022/12/293:52:1903:52:1929December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。3:52:19上上午3:52上上午03:52:1912月-229、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很多多事情情努力力了未未必有有结果果，但但是不不努力力却什什么改改变也也没有有。。。03:52:1903:52:1903:5212/29/20223:52:19AM11、成功功就是是日复复一日日那一一点点点小小小努力力的积积累。。。12月月-2203:52:1903:52Dec-2229-Dec-2212、世间间成事事，不不求其其绝对对圆满满，留留一份份不足足，可可得无无限完完美。。。03:52:1903:52:1903:52Thursday,December29,202213、不知香香积寺，，数里入入云峰。。。12月-2212月-2203:52:1903:52:19December29,202214、意意志志坚