第章基因重组和基因工程2

基因重组和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering王海河中山医学院第14章DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久，Sanger等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology)接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座重组

(transposition)同源重组

(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)第一节

自然界DNA重组和基因转移

DNARecombinationandGeneTransferinNature发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组E.Coli的同源重组机制RecBCD复合物具有三种酶活性：核酸外切酶、核酸内切酶、解螺旋酶Chi位点：序列为5’GCTGGTGG3’，是目前发现的主要重组热点RecA酶：E.coli同源重组过程中最重要的酶，又称为重组酶。可结合单链DNA，并将此DNA插入双链DNA分子的同源区，完成DNA分子间单链交换的重组过程。Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一或两个DNA中的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体Holliday模型异源重组体的修复异源双双链重重组体体内不不配对对片段段的DNA修复二、细细菌的的基因因转移移与重重组（一））接合合作用用当细胞胞与细细胞、、或细细菌通通过菌菌毛相相互接接触时时，质质粒DNA从一个个细胞胞（细细菌））转移移至另另一细细胞（（细菌菌）的的DNA转移称称为接合作作用(conjugation)。可接合合质粒粒如F因子(Ffactor)细菌染染色体体外的的小型型环状状双链链DNA分子。。质粒（二））转化化作用用通过自自动获获取或或人为为地供供给外外源DNA，使细细胞或或培养养的受受体细细胞获获得新新的遗遗传表表型，，称为为转化作作用(transformation)。例：溶菌时时，裂裂解的的DNA片段被被另一一细菌菌摄取取。（三））转导导作用用当病毒毒从被被感染染的（（供体体）细细胞释释放出出来、、再次次感染染另一一（供供体））细胞胞时，，发生生在供供体细细胞与与受体体细胞胞之间间的DNA转移及及基因因重组组即为为转导作作用(transduction)。λ噬菌体体的生生活史史溶源菌菌生长长途径径(lysogenicpathway)“和平平共处处”溶菌生生长途途径(lysispathway)“杀死死宿主主”三、位位点特特异重重组(site-specificrecombination)位点特特异性性重组组发生生在特殊序序列对对之间，，这一一重组组型式式最早早在λ噬菌体体的遗遗传学学研究究中发发现。。λ噬菌体体有两两种存存在型型式：：裂解状状态和和溶源源状态态。两种种类型型间的的转换换通过过位点点特异异性重重组实实现。。溶源菌菌生长长途径径溶菌生生长途途径λ噬菌体体的整合酶酶识别噬噬菌体体和宿宿主染染色体体的特异靶靶位点点发生选选择性性整合合；反反转录录病毒毒整合酶酶可特异异地识识别、、整合合反转转录病病毒cDNA的长末端端重复复序列列(longterminalrepeat,LTR)。（一））λ噬菌体体DNA的整合合λ噬菌体体DNA的整合合与切切除为了进进入溶溶源状状态，，游离离的DNA必须整合（intergrate）到细细菌DNA中去；；而为为了从从溶源源状态态向裂裂解状状态转转化，，原噬噬菌体体DNA则必须须从细细菌染染色体体DNA上切除（excise）。整合和和切除除均通通过细细菌DNA和λDNA上特定位位点—附着点点（attachmentsite，att）之间间的重重组而实现现。细菌染染色体体上的的附着着点（（attλ）称为attB，含有B、O、和B’三个序序列（（BOB’），长长度约约25bp。attB突变后后可以以阻止止λDNA的整合合。O序列15bpλ噬菌体体的附附着位位点称称attP，由P、O和P’三个序序列组组成，，长度度约为为240bp。其中O序列是attB和attP所共有的的，序列列完全一一致，长长度15bp,称核心序序列（coresequence）。是位位点特异异性重组组发生的的地方。。O序列IntegrationHostFactor2.λλ-DNA从E.coli的切离：：噬菌体的的整合和和切除1.λλ-DNA对E.coli的整合：：BOP’’—POB’（原噬菌菌体）BOB’’（细菌））+POP’’（噬菌体体）IntIHFBOP’’—POB’（原噬菌菌体）BOB’’（细菌））+POP’’（噬菌体体）Int，XisIHF整合过程程◘整合后的的附着位位点为attL（BOP’’）attR（POB’’）◘整合位点点---attB、attP切除位点点---attL、attR◘整合过程程需要Int和IHF共同作用用切除过程程还需要要Xis蛋白，Xis通常抑制制整合。

调节和启动转录

LTR

gag

pol

env

src

LTR

长末端重复序列癌基因正常的病毒基因产生病毒表面糖蛋白产生逆转录酶和整合酶

产生病毒垮膜蛋白反转录病病毒基因因组结构构产生p60src蛋白质，，靶蛋白白磷酸化化（二）细细菌的特特异位点点重组沙门菌H片段倒位位决定鞭鞭毛相转转变。鼠伤寒沙沙门氏菌菌有两相相:Ⅰ相：由H1基因表达达产生H1鞭毛蛋白白Ⅱ相：由H2基因表达达产生H2鞭毛蛋白白两相细菌菌在进行行细胞分分裂时，，以大约约1/1000的频率产产生另一一相的后后代，此此过程称称为相变变（phasevariation）。相变的实实质是Hl或H2基因选择择性表达达的结果果H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位位决定鞭鞭毛相转转变H抗原刺激激机体后后主要产产生IgG，H抗原分析析是沙门门氏菌定定型的依依据。自然界中中存在着着数以百百万计的的各种抗抗原物质质，若一一种抗体体分子特特异性识识别和结结合一种种抗原，，体内如如何产生生这么多多种类的的抗体分分子呢？？抗体产生特异性免疫应答的重要分子机制就是免疫球蛋白（IG）的基因重排。

免疫球蛋蛋白的基基因重排排（三）免免疫球蛋蛋白基因因的重排排免疫球蛋蛋白(Ig)，由两条条轻链(L链)和两条重重链(H链)组成，分分别由三三个独立立的基因因族编码码，其中中两个编编码轻链链(和)，一个编编码重链链。轻链的基基因片段段：重链的基基因片段段：LVJCLV

D

JC免疫球蛋蛋白（Ig）的结构构Ig由两条轻轻链(L链)和两条重重链(H链)组成，分分别由三三个独立立的基因因族编码码，其中中两个编编码轻链链(和)，一个编编码重链链。人免疫球蛋白染色体定位编码的肽链基因符号染色体定位基因片段及排列组合数H链IgH14q32.3V65-D30-J6-C965×30×6＝11700κ链Igκ2p11-12V50-J5-C50×5＝250λ链Igλ22q11.2V50-100-(J-C)450×4＝200重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻轻链(IgL)基因的V-J重排均发发生在特异位点点上。在V片段的下下游，J片段的上上游以及及D片段的两两侧存在在保守的的重组信信号序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。CACAGTG(NNNNNNN…)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN…)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位点点重组酶识识别位点点此重排的的重组酶酶共有两两个，分分别由基基因rag1、2(recombinationactivatinggene)编码。RAG1：识别9bp信号序列列。RAG2：结合于于RAG1，并在7bp序列处切切割。单链切开RAG1RAG2免疫球蛋蛋白基因因重排过过程V片段J片段RSS间插DNARSSOHOHV片段J片段分子内转酯反应V片段J片段单链切开、转移核苷酸修复、连接V片段J片段CACAGTG(NNNNNNN…)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN…)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位点点重组酶识识别位点点基因拼接接过程中中的转酯酯反应7nt切割位点点9nt重组酶识识别位点点H重链L1V1LnVnD1-12J1-4CμCδL1V1LnVnJ1-4Cκκ轻链转录、加加工AAA翻译新生多肽链成熟多肽链L1V1LnVnD2J1CμCδL1V1D2J1CμCδL1V1D2J1CμL1V1J1CκAAAL1V1J1Cκ组合成Ig分子小鼠Ig胚系基因因片段和和重链、、κ轻链配对对的多样样性基因片段段数可可变变区基因因经经重排排和随机机配对后后多肽链VJ重组方式式推推算的多多样性数数目重链1000124V-D-J4.8×104κ轻链2504V-J1.0×103概念：由由插入序序列和转转座子介介导的基基因移位位或重排排称为转转座(transposition)。指DNA从一个位位置移动动到基因因组上另另一个位位置。这这些可移移动的DNA序列包括括：（一）插插入序列列(insertionsequences,IS)（二）转转座子（（transposons）四、转座座重组插入序列列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插插入序列列转座二个分离离的反向向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正正向重复复序列一个转座座酶（transposase)编码基因因保守性转转座(conservativetransposition)复制性转转座(duplicativetransposition)保守性转转座(conservativetransposition)复制性转转座(duplicativetransposition)插入序列列的复制制性转座座转座子(transposons)——可从一个个染色体体位点转转移到另另一位点点的分散散重复序序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转转座子转转座转座子组组成：反向重复复序列转座酶编编码基因因抗生素抗抗性等有有用的基基因BarbaraMcClintock(1902-1992),Biologist.NobelPrizefordiscovering"jumpinggenes"incorn---theninbacteriaandhumans.ColdSpringHarborLaboratory.细菌的可可流动性性元件A插入序列列：转座酶编码基因因两侧连连接反向向末端重重复序列列(箭头所示示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶酶及阻遏遏蛋白编编码基因因C转座子Tn10：含四环环素抗性性基因及及两个相相同的插插入序列列IS10L由转座子子介导的的转座相关概念念DNA克隆工具酶目的基因因基因载体体基本原理理重组DNA技术与医医学的关关系主要内容容：第二节DNA重组技术术DNARecombinationTechnique一、重组组DNA技术相关关概念克隆(clone):来自同一一始祖的的相同副副本或拷拷贝的集集合。获取同一一拷贝的的过程称称为克隆隆化(cloning)，即无性性繁殖。。（一）DNA克隆分子克隆：细胞克隆：动物克隆：克隆的不同层面应用酶学学的方法法，在体体外将各各种来源源的遗传传物质（（同源的的或异源源的、原原核的或或真核的的、天然然的或人人工的DNA）与载体体DNA接合成一一具有自自我复制制能力的的DNA分子——复制子(replicon)，继而通通过转化化或转染染宿主细细胞，筛筛选出含含有目的的基因的的转化子子细胞，，再进行行扩增提提取获得得大量同同一DNA分子，也也称基因克隆隆或重组组DNA(recombinantDNA)。DNA克隆生物技术术工程:基因工程程、蛋白白质工程程、酶工工程、细细胞工程程等目的：①分离离获得某某一感兴兴趣的基基因或DNA②获得感兴兴趣基因因的表达达产物（（蛋白质质）基因工程程(geneticengineering)——实现基因因克隆所所用的方方法及相相关的工工作称基基因工程程，又称称重组DNA工艺学。。（二）工工具酶限制性核核酸内切切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶酶T4DNA连接酶碱性磷酸酸酶末端转移移酶TaqDNA聚合酶（1）定义：：识别DNA的特异序序列,并在识别别位点或或其周围围切割双双链DNA的一类内内切酶，，简称限限制酶。。限制性核核酸内切切酶存在在于细菌菌体内，，与细菌菌的甲基基化酶构构成限制－修修饰体系系。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+限制性核核酸内切切酶(restrictionendonuclease,RE)分子手术术刀（2）限制酶酶的分类类:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类（3）限制酶的的命名EcoRⅠE：代表细菌菌的属名名co：代表细菌菌的种名名R：代表菌株株Ⅰ：发现次序序名称属名种名株名序号来源菌株EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliRY13HindⅢHIndⅢHaemophiliusinfluenzaeRdHpaⅠHpaⅠHaemophilusparainfluenzae（4）限制酶酶的特点点①识别序列列：回文文结构5`---GAATTC---3`3`---CTTAAG---5`不同碱基个数的识别序列在基因组中的出现频率：四：256bp六：4kb八：65kbBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口②切割方方式来源不同同的限制制酶，但但能识别别和切割割同一位位点，这这些酶称称同功异源源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源源酶：有些限制制性内切切酶虽然然识别序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，产生生相同的的粘性末末端，称称为同尾尾酶。这这两个相相同的粘粘性末端端称为配配伍未端端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性内内切核酸酸酶（三）目目的基因因研究某个个基因，，或者要要克隆某某个基因因用于生生产大量量DNA和蛋白质质分子,首先都要要把它从从庞大的的基因组组中分离离出来。。你所感兴兴趣和想想研究的的基因，，称为目目的基因因。基因组DNA(genomicDNA)cDNA(complementaryDNA)（四）基基因载体体定义为携带目目的基因因，实现现其无性性繁殖或或表达有有意义的的蛋白质质所采用用的一些些DNA分子。常用载体体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA分子运输车克隆载体体(cloningvector)为使插入入的外源源DNA序列被扩扩增而特特意设计计的载体体称为克隆载体体。表达载体体(expressionvector)为使插入入的外源源DNA序列可转转录翻译译成多多肽链而而特意设设计的载载体称为为表达载体体。载体的选选择标准准：能自主复复制；具有两个个以上的的遗传标标记物，，便于重重组体的的筛选和和鉴定；；有克隆位位点（外外源DNA插入点）），常具具有多个个单一酶酶切位点点，称为为多克隆隆位点；；分子量小小，以容容纳较大大的外源源DNA。1.质粒(plasmid)特点①能在在宿主细细胞内独独立自主主复制；；带有某某些遗传传信息,会赋予宿宿主细胞胞一些遗遗传性状状。②②大小适适宜，拷拷贝数多多。③易易于从一一个细菌菌转移到到另一个个细菌，，即易转转化。④④有利于于筛选。。质粒上上常带有有一个或或两三个个抗药基基因。⑤⑤有限制制性内切切酶的切切口。λ噬菌体DNA改造系统统λgt系列（插插入型，，适用cDNA克隆）EMBL系列（置置换型，，适用基基因组克克隆）噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列3.粘性质粒(cosmid)酵母人工染染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体体（如腺病毒毒，腺病毒毒相关病毒毒，逆转录录病毒）其他克隆容量：：质粒：<10kbλ噬菌体<22kbM13噬菌体<1kb粘粒<40-50kbYAC：0.5-2Mb二、重组DNA技术基本原原理目的基因的的获取克隆载体的的选择和构构建外源基因与与载体的连连接重组DNA导入受体菌菌重组体的筛筛选克隆基因的的表达基因工程的的基本过程程（一）目的的基因的获获取化学合成法法要求：已知知目的基因因的核苷酸酸序列或其其产物的氨氨基酸序列列。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反反应(polymerasechainreaction,PCR)化学合成法法获取目的的基因由已知氨基基酸序列推推测可能的的DNA序列。组织或细胞胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子子的转化菌菌限制性内切切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化化细胞内由由克隆载体体所携带的的所有基因因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割割的真核生生物染色体体DNA片段构建基基因文库mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT利用聚合酶酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)获取取目的基因因（三）外源源基因与载载体的连接接方式：(1)同一限制酶酶切位点连连接(2)不同限制酶酶切位点连连接配伍末端连连接非配伍末端端连接粘性末端连连接（二）克隆隆载体的选选择和构建建目的不同，，操作基因因的性质不不同，载体体的选择和和改建方法法也不同。。BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶酶切位点连连接不同限制酶酶切位点（（非配伍末末端）的连连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的的连接情况况和同一限限制酶切位位点连接相相似。平端连接限制性内切切酶切割产产生的平端端粘端补齐或或切平形成成的平端适用于：优点：使用用范围广缺点：连接接效率较低低目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连在末端转移移酶(terminaltransferase)的作用下，，在DNA片段末端加加上同聚物物序列、制制造出粘性性末端，再再进行粘端连接。同聚物加尾尾连接由平端加上上新的酶切切位点，再再用限制酶酶切除产生生粘性末端端，而进行行粘端连接。人工接头(linker)连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´人工接头及及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受体菌条件件：安全宿主菌菌限制酶和重重组酶缺陷陷处于感受态态(competent)导入方式：：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组组DNA导入受体菌菌宿主菌细胞胞经适当的的理化处理理，处于最最适于接受受重组体的的状态，称称感受态细细胞。比如如大肠杆菌菌在低温下下处于CaCl2溶液中一段段时间，其其膜通透性性增加处于于感受态。。E.Coli感受态细胞胞的制备1.直接选择法法(1)抗药性标记记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法法如免疫化学学方法及酶酶免检测分分析等（五）重组组体的筛选选(插入失活法法)抗药性标记记选择(2)标志补救(markerrescue)组氨酸缺陷陷型大肠杆菌菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘甘油磷酸脱水酶基因因促进组氨酸酸合成λDNA重组体乳糖操纵子子的天然诱诱导物是乳糖乳糖类似物物异丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷（IPTG）有更强强的诱导作作用。IPTG配合使用在在基因工程程可作蓝白白斑筛选。。LacZ基因编码的的β-半乳糖苷酶酶X-gal蓝色吲哚产产物蓝白斑试验验（IPTG-Xgal试验）诱导物ZYXPOZYXPO乳糖标志补救（（ß-半乳糖苷酶酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-galα互补（蓝白白筛选）（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因C端序列LacZ酶Southern印迹（3）分子杂交交法原位杂交当溶液中的的DNA分子经高温温或高pH处理后，DNA双链分子变变性产生两两条单链，，如果将温温度逐渐下下降或pH恢复到中性性，单链会会按照碱基基互补配对对的原则，，重新形成成氢键恢复复到原来的的双链结构构。如果两两条单链的的来源不同同，只要它它们之间的的碱基顺序序同源互补补或者部分分同源互补补，在条件件适宜时，，就可以全全部或部分分复性——分子杂交。。99原位杂交技技术将标记探针针与细胞或或组织切片片中的核酸酸进行杂交交，进而检检测特异的的DNA或RNA序列。细胞原位杂杂交组织切片原原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA优点：不需提取核核酸，故可可完整保持持组织或细细胞的形态态，因而更更能准确地地反映组织织细胞的功功能状态。。以特异序列列为探针鉴鉴定rDNA在染色体上上的分布鸡的β肌球蛋白的的克隆和检检出免疫学方法法重组DNA技术操作过过程为：小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

重组DNA技术操作的的主要步骤骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交表达体系的的建立：表达载体的的构建受体细胞的的建立表达产物的的分离纯化化（六）克隆隆基因的表表达标准：选择标志强强启启动子翻译调控序序列 多接接头克隆位位点E.coli表达体系的的不足：不宜表达真真核基因组组DNA；不能加工表表达的真核核蛋白质；；表达的蛋白白质常形成成不溶性包包涵体(inclusionbody)；很难表达大大量可溶性性蛋白。1.原核表达体体系(E.coli表达体系最最为常用)大鼠胰岛素素原cDNA的表达和分分泌真核基因在在原核系统统表达的困困难及其解解决方法将真核基因因克隆到1个强大的原原核promotor和SD的下游，使使真核基因因处于原核核启动子的的控制之下下，转录物物由于原核核SD能与核糖体体rRNA结合，可在在原核表达达.这是克服1、2困难的好办办法。真核分离出出mRNA并逆转录成成cDNA，cDNA有完整的编编码顺序，，但无内含含子。采用伪装办办法：将真真核基因插插到原核基基因某密码码之后，其其翻译产物物N端有原核多多肽，这样样表达的融融合蛋白，，可躲避细细菌蛋白酶酶降解作用用。1.细菌RNApol不能识别真真核的promotor，故真核基基因不能被被该酶转录录.2.从真核转录录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到到细菌核糖糖体rRNA,因此不能被被翻译成蛋蛋白.3.真核基因有有内含子,而原核细胞胞缺乏真核核细胞转录录后加工系系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真真核蛋白;4.表达的真核核蛋白在原原核细胞中中不稳定,易被细菌蛋蛋白酶降解解.优点：可表达克隆隆的cDNA及真核基因因组DNA可适当修饰饰表达的蛋蛋白质表达产物分分区域积累累缺点：操作技术难难、费时、、经济转染——将表达载体体导入真核核细胞的过过程方法：磷酸钙转染染DEAE葡聚糖介导导转染电穿孔脂质体转染染显微注