细菌种属的分子鉴定

用16SrDNA方法鉴定细菌种属一、目的掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，女Q(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。利用16SrDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤细菌基因组DNA提取挑单菌落接种到10mLLB培养基中37°C振荡过夜培养。取2mL培养液到2mLEppendorf管中，8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。加140pLTE打散细菌，再加入60应10mg/ml的溶菌酶。37C放置10分钟。加入400pLDigestionBuffer，混匀。再加入3pLProteinK，混匀，55C温育5分钟。加入260pL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。加入500pL70%乙醇(WashSolution)，10000rpm离心0.5分钟。重复第六步。再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。加入50应预热(60°C)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。电泳。取3应溶液电泳检测质量。PCR扩增根据已发表的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。16S(F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'16S(R)5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'PCR扩增体系：在0.2mLEppendorf管中加入1pLDNA，再加入以下反应混合液：16S(F)1pL(10pM)16S(R)1pL(10pM)10xPCRBuffer5pLdNTP4pLTaq酶0.5pL加ddH2O使反应体系调至50pL,简单离心混匀。PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：94C3min94C30sec、50C45sec*35cycles72C100sec"72C7minPCR产物的电泳检测拿出Eppendorf管，从中取出5pL反应产物，加入1pL上样缓冲液，混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1hr。在紫外灯下检测扩增结果。扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。称量一2mL.的Eppendorf管质量，记录。在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。每100mg凝胶加入100pLBindingBuffer，混匀。60C温育至凝胶融化4）全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。5）加入500gLBindingBuffer，10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。6）加入70%乙醇（WashSolution）,10000rpm离心0.5分钟。7）再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。8）加入30gL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。（四）DNA片段测序将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16SP